Abstrakt
kromě abnormality motor a držení těla, děti s dětskou mozkovou obrnou (CP), často mají mentální postižení. Jako doplňková a alternativní tradiční čínská medicína (TCM) terapie, Čínská Tuina masáž, také nazývaná Tuina v Číně, byla široce používána v klinické léčbě CP v Číně po dlouhou dobu. Molekulární základ pro to však stále zůstává do značné míry neznámý., V poslední době se ukázalo, že hydroxymethylace DNA je citlivá na životní prostředí a hraje rozhodující roli v některých neurologických poruchách, zatímco výzkum zaměřený na vztah mezi 5 hmC a Tuina terapií pro mozkovou obrnu je nedostatečný. V naší studii jsme poprvé pozorovali, že Tuina zlepšila učení a paměťové funkce hypoxicko-ischemických (HI) potkaních mláďat. Mezitím se 5 hmC hladina kůry temporálního laloku v HI novorozeneckém modelu potkanů výrazně snížila ve srovnání s hladinou potkanů v kontrolních a Tuinových skupinách., Poté jsme použili metodu hMeDIP-Seq, abychom prozkoumali, zda a jak se hydroxymethylace DNA podílí na terapii tuiny pro mozkovou obrnu. Genomická anotace DhMRs hypo-hydroxymethylace HI group k genům odhalila obohacení ve více neurodevelopmentálních signálních drahách. Navíc jsme zjistili, že vyčerpání 5 HMC modifikací v genech spojených s vývojem neuronů bylo doprovázeno sníženými hladinami mRNA těchto genů., Celkově vzato, naše výsledky naznačují, že Tuina může regulovat expresi neurovývoji související s geny změnou stavu DNA hydroxymethylation, a tím zlepšuje učení a paměť funkce mozkové obrny.
1. Úvod
poranění mozku vyskytující se během perinatálního období je hlavní příčinou získané invalidity., Výskyt poranění mozku u dětí souvisí s mnoha faktory, jako je hypoxie-ischemie, infekce, oxidační stres a zánětlivé reakce, mezi které hypoxie-ischemie (HI) může vyvolat mozkovou obrnou (CP), což vyvolalo perinatální mozkové léze u předčasně narozených . CP je nejčastější novorozenecké chronické postižení, vyznačující se tím, motorické a posturální poruchy, a je často doprovázena kognitivní a učení deficity . V základních vědeckých studiích byl model Hi neonatální krysy široce používán při zkoumání výsledků chování a patogeneze mozkové obrny ., Navzdory velkému pokroku ve studiích CP zůstávají molekulární mechanismy toho, jak hypoxie-ischémie přispívá k rozvoji a progresi CP, stále nejasné.
Do dnešního dne, aktuální terapie pro CP zahrnuje především ortopedické operace, antispasticity léky, a různé druhy motorického učení zásahů , z nichž většina pouze práci, k léčbě komplikací spojených s CP a může přinést nežádoucí účinky., Nicméně, tradiční Čínská medicína (TCM), včetně Tuina, akupunktura, bylinné medicíny, a to samostatně nebo v kombinaci s konvenční léčbou západní medicíny, byl široce používán jako alternativní léčbu pro CP v Číně . Tuina je starodávná forma lékařské masáže v čínské medicíně, s aplikovaným tlakem prstů na akupunktury, které jsou patologicky senzibilizovány poškozením orgánů . Zejména Tuina jako bezpečnější a účinnější zásah vykazovala v klinické praxi zjevné účinky na mozkovou obrnu. Přesný mechanismus fungování Tuiny na CP však Dosud nebyl objasněn.,
naopak, patogenně, epigenetické modifikace citlivé na životní prostředí již byly prokázány , že se podílejí na neurogenezi , učení a paměti a synaptické plasticitě . Mezi různých epigenetických modifikací, metylace DNA na pátý uhlík cytosinu (5-methylcytosine, 5 mC) je nejvíce studovaných epigenetických modifikací, která hraje důležitou roli ve struktuře chromatinu remolding, transkripční potlačení a buněčné diferenciace ., Kromě toho, oxidací 5-mC do 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) ten-eleven translocation (TET) genové rodiny je navrženo jako román mechanismus pro odstranění 5 mC a 5-hmC byla navrhl, aby se v kritické údržby neuronu, struktura a funkce, vzhledem k jeho zjevné obohacování v mozku . Mezitím, 5 hmC změna je také identifikován mnoho studií, které mají být spojeny s neurologickými poruchami, jako je Alzheimerova choroba , Rettův syndrom , fragile X-associated tremor/ataxie syndrom , Huntingtonova choroba a poruchy autistického spektra ., Tyto důkazy poskytly základ pro hypotézu, že změny 5 hmC mohou hrát rozhodující roli při onemocnění nervového systému.,
prozkoumat přítomnost zapojení Tuina terapie při změně 5 hmC v CP, jsme použili zavedený chemické značení a afinitní purifikace metody ve spojení s high-throughput sekvenování technologie odhalit možné genomu-široký 5 hmC změny v HI potkanů před a po Tuina ošetření za účelem hledání vztahu mezi 5 hmC a Tuina léčebné účinky na CP, čímž poskytuje důkazy na podporu použití Tuina terapie pro dětskou mozkovou obrnou.
2. Materiály a metody
2.1., Animal Modelu
Všechny experimenty byly schváleny Etickou komisí pro Péči o zvířata, Jinshan Nemocnice přidružená k Fudan University. Upravený model Rice-Vannucci byl použit, jak bylo popsáno výše . Novorozenecké AHOJ modelu byla provedena na Sprague-Dawley krysí samec mláďata (Slac Laboratorních Zvířat Společnost, Šanghaj, Čína) na postnatální den 3 (P3) přes podvázání levé společné krční tepny pod 3% isofluranu anestezii. Doba operace pro každou krysu byla kontrolována během 10 minut., Po zotavení po dobu 1 hodiny, tyto mláďat byly umístěny v hypoxii komoře při 37°C a s výhradou plynu směšovač složený z 8% O2 a 98% N2 za 3,5 hodiny. Podvod zvířata měla stejnou operaci vystavit společné krční tepny bez ligace a hypoxie. Po operaci se krysí mláďata vrátila do své domácí klece.
2.2. Tuina Ošetření
Tuina byla léčba provádí specializovaný pracovník s odborným lékařem osvědčení. Od dne P4 do P31 přijala krysí mláďata ve skupině Tuina zásah Tuina, který se provádí 120krát / min po dobu 15 minut, jednou denně.,f Tuina je následující: první, potkan byl umístěn na dlani manipulátor levé ruky, aby se přizpůsobily prostředí; za druhé, manipulátor používá prostřední prst pravé ruky, jemně třít krysa od krku k ocasu třikrát uvolnit své svaly; za třetí, Tuina bylo provedeno následné tření, hnětení, a jeden prst tlačí podél páteře krysy od shora dolů a zevnitř ven na hřbet a ambilateral vazy i svaly podél městě meridian a močového měchýře meridian krysy s odkazem na související tradiční Čínské medicíny (TCM) funguje.,
2.3. Vzpřimovacího Reflexu
Vzpřimovacího reflexu z novorozených potkanů byla hodnocena z P5 až P11, jak je popsáno předtím . Během tohoto testu byla mláďata potkanů umístěna v poloze na zádech na vyčištěném rovném povrchu a byl změřen čas, aby tato štěňata dosáhla náchylné polohy se všemi čtyřmi tlapkami.
2.4. Reflex chůze
krysí mláďata byla umístěna ve středu bílé zaoblené lepenky (průměr 13 cm) a den, kdy se posunuli z kruhu s oběma předními končetinami, byl zaznamenán .
2.5., Nakloněná Rovina Test
Tento test byl použit k měření končetiny sílu tím, že nahrávání maximální úhel svahu, na který mláďat potkanů může stále daří přilnavost na den P21, jak je znázorněno na Obrázku 1(b) . Během této zkoušky byly krysy umístěny směrem doprava nebo doleva a úhel roviny byl zvýšen o 5° každých pět sekund, aby se určil maximální úhel sklonu, ke kterému by potkan mohl stále držet .
2.6. Step-Down Avoidance Test
tento test byl implementován pro měření retence paměti . Krysa byla jemně umístěna na válcové izolační plošině (4.,5 cm v průměru a výšce) v klimatizační komoře pro přizpůsobení okolnímu prostředí po dobu 3 minut. Jakmile krysa sestoupí z plošiny, bude okamžitě elektrifikována. V 5 minut-trénink (P26), krysy byli vyškoleni, aby skočit zpět na platformu, aby se zabránilo elektrické stimulace. V testovacích relacích (24 h po tréninku, tj.
2.7., Morris Water Maze (MWM) Test
aby bylo možné vyhodnotit prostorové učení a paměť, byl test Morris water maze proveden po dobu 5 dnů, jak bylo dříve popsáno . Vodní bludiště (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Šanghaj, Čína) bylo rozděleno na čtyři kvadranty a plošina (průměr 5 cm) byla umístěna 1 cm pod vodní hladinou v jednom kvadrantu. V trénincích (P27–P30) byly všechny krysy trénovány čtyřikrát denně po dobu čtyř po sobě jdoucích dnů a bylo jim umožněno najít skrytou platformu do 60 s., Pokud krysa nenalezla plošinu do 60 s, byla jemně vedena k plošině a před odesláním zpět do klece jí umožnila zůstat 30 s. V den zkoušky prostorové sondy (P31) byla plošina odstraněna a krysy byly uvolněny do vody směřující ke stěně bazénu ze stejné polohy jako v trénincích. Následně byly zaznamenány pohybové stopy a počet přechodů pro umístění nástupišť.
2.8., Dot Blotting
Po dokončení výše uvedených zkoušek mláďat potkanů byly obětovány na P31 a jejich mozky byly vyjmuty pro sběr celkové DNA levého temporálního kortexu pomocí QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Německo). 2,5 µL genomická DNA (100 ng/µL) byla spatřena na nylonových membránách a následovalo pečení při 80°C po dobu 30 minut na křížovou DNA . Po zablokování 5% netučného mléka po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě byla membrána inkubována polyklonální protilátkou 5 hmC (ředění 1 : 1000, Active Motif, Spojené státy, Kat. Č., 39769) při 4 ° C přes noc a druhý den byla použita konjugovaná sekundární protilátka s křenovou peroxidázou (HRP). Membrána dot blot byla obarvena 0,02% methylenovou modří (MB), aby bylo zajištěno stejné zatížení.
2.9. Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation (hMeDIP) Analýza a High-Propustnost Sekvenování
Genomová DNA byla extrahována z levé temporální kůře potkaních mláďat (kontrolní: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) a ozvučují na 200-350 párů bází (bp). A fragmenty DNA byly nakonec opraveny; adaptéry A-tailed a Illumina byly ligovány., Poté byla denaturována DNA ligovaná adaptérem a inkubována s protilátkou 5 hmC (Active Motif, Spojené státy, Cat. Č. 39769) při 4 ° C přes noc. Komplexy protilátka-DNA byly zachyceny proteinovými perličkami a / G. Imunoprecipitovaná DNA byla vyčištěna a podstoupila sekvenování s vysokou propustností prováděné na systému Illumina HiSeq3000 (Illumina, Spojené státy americké).
2.10. Mapování sekvenačních dat a bioinformatiky
zpracování sekvenačních dat bylo provedeno tak, jak bylo popsáno výše . Fastq sekvenční soubory po biologické duplikace byly zarovnány s UCSC rat referenčního genomu (RGSC6.0/rn6) ., Unikátní, nonduplikátové čtení bylo použito pro špičkové volání a anotaci hypergeometrickou optimalizací obohacování motivů (HOMER) . 5-hmC enrichment peaks byly stanoveny pomocí modelové analýzy softwaru ChIP-Seq (MACS). A rozdílně hydroxymethylované oblasti (DhMRs) byly identifikovány mezi všemi páry vzorků obohacených 5-hmC přímým porovnáním jednoho vzorku s druhým v každém směru . Pomocí Davida byly provedeny analýzy genové ontologie (GO).
2.11. Kvantitativní RT-PCR
celková RNA byla extrahována z levé kůry temporálního laloku., Reverzní přepis cDNA byl proveden pomocí PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japonsko). Kvantitativní RT-PCR reakce byly provedeny na 7500 real-time PCR systému (Applied Biosystems, Spojené státy) pomocí SYBR green (Takara, Japonsko). β-aktin byl použit jako vnitřní kontrola a relativní exprese cílového genu byla určena metodou 2-ΔΔCT., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blot Assay
izolované levém spánkovém laloku mozkové kůry byl přidán s ledovou proteinu lyzátu a centrifugována při 12000 ot/min po dobu 20 min při teplotě 4°C. Protein vzorky byly odděleny pomocí elektroforézy SDS-PAGE a přeneseny na PVDF membrány (Millipore, usa). Po blokování 5% netučného mléka po dobu 2 hodin při pokojové teplotě byly membrány inkubovány s primárními protilátkami při 4°C přes noc a poté inkubovány s HRP-konjugovanými sekundárními IgG protilátkami. Primární protilátky zde používané zahrnovaly anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Kat. Č., 191698), anti-Tet2 (1 : 1000, Millipore, Spojené státy, Kat. # ABE364), Anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, UK, Kat. Č. 110767) a anti-β tubulin (1 : 2000, technologie buněčné signalizace, Spojené státy, Kat. #2128). Membrány byly poté vyvinuty pomocí detekce ECL a signály byly detekovány pomocí chemiluminiscenčního zobrazovacího systému Tanon-5200 (Tanon, Šanghaj, Čína). Hladiny bílkovin byly analyzovány softwarem Image J (NIH, Bethesda, USA) a normalizovány na odpovídající úroveň β-tubulinu.
2.13., Imunofluorescenční Konfokální Mikroskopie
mláďat Potkanů byly obětovány na P31, a jejich srdce perfundované s 0,9% fyziologickým roztokem a následně 4% paraformaldehydem (PFA). Po perfuze, mozky byly vyjmuty a pevné v 4% PFA přes noc, následoval tím, že vložené do parafínu a do 5 µm sériové řezy. Po získání mikrovlnného antigenu v pufru kyseliny citronové při 95°C byly nespecifické místa blokovány 5% bovinního sérového albuminu (BSA) po dobu 1 hodiny při pokojové teplotě. Dále byly části mozku inkubovány s 5 hmC primární protilátkou (1 : 1000, Active Motif, Spojené státy, Cat. Č., 39769) přes noc při 4°C, následuje inkubace se sekundární protilátkou (1 : 200, Život, Technologie, Spojené Státy americké) 1 h při 37°C. 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) byl použit pro jaderné imunofluorescenční barvení, imunofluorescence obrázky byly vizualizovány a zachytil na konfokálním mikroskopu (Leica sp5, Německo).
2.14. Statistická analýza
všechna data byla vyjádřena jako průměrná ± standardní chyba střední hodnoty (SEM) a analyzována pomocí SPSS., K určení rozdílů mezi 3 skupinami byla použita jednosměrná analýza rozptylu (ANOVA), následovaná neparametrickým t-testem a Tukey čestně významným rozdílem. hodnota < 0.05 byla považována za statisticky významnou.
3. Výsledky
Tuina zlepšila úbytek hmotnosti, slabost síly končetin a poruchy neurologických reflexů vyvolaných HI.,
Tělesné hmotnosti mláďat potkanů byla měřena z P4 na P28, a bylo zjištěno, že z P22 na P28, tělesné hmotnosti potkanů v Tuina skupiny (n = 11) se zvýšil výrazně ve srovnání s HI skupiny (n = 11; Obrázek 1(a)). Výsledky testu nakloněné roviny ukázaly, že maximální úhly byly ve skupině Tuina vyšší než úhly ve skupině HI (Obrázek 1(b)), což naznačovalo zlepšení slabosti síly končetin ve skupině Tuina., Výsledky nervového systému reflexy byly následující: v chůzi reflexy test, krysí mláďata v HI skupiny začal pohybovat pryč z kruhu s oběma přední končetiny výrazně později než ty, v kontrole a Tuina skupin (Obrázek 1(c)). Při testu reflexu pravosti se krysy ve skupině Tuina snažily napravit kratší čas než ty ve skupině HI od P7 do P11 (Obrázek 1(d))).
Tuina podporovala učení a paměťové funkce hypoxicko-ischemických mláďat potkanů.,
test Morris water maze a test step-down byly provedeny za účelem vyhodnocení funkcí učení a paměti potkanů. Jak je znázorněno na obrázku 2(a), pohybové Stopy ve zkušebním dni sondy testu MWM ukazují, že počet přechodů polohy plošiny skupiny HI byl výrazně nižší než počet kontrolních skupin a skupiny Tuina (Obrázek 2(b))). V testu step-down vykazovaly Hi krysy výrazně kratší dobu latence a více chyb ve srovnání s potkany control a Tuina (obrázky 2(c) a 2(d))).
Tuina zvýšila 5 hladin hmC a Tet2 v mozkové temporální kůře HI potkanů.,
posoudit, zda úroveň 5 hmC byl ovlivněn během CP rozvoj, jsme provedli dot blot testy a zjistil, že 5 hmC úroveň HI potkanů výrazně snížil ve srovnání s kontrolou, zatímco tato úroveň byla částečně zvýšena po Tuina (; Obrázek 3(a)). Mezitím, imunofluorescenční barvení prokázala, sloučení 5 hmC a DAPI barvení a HI vedlo k poklesu genomické 5 hmC v levé temporální kůře, zatímco Tuina léčba obnovena 5 hmC úrovni do určité míry (viz Obrázek 3(b)), což bylo v souladu s výsledky dot blotting., Navíc, jak je znázorněno na Obrázcích 3(c) a 3(d), HI skupiny, zobrazí se snížil Tet1 a Tet2 exprese ve srovnání s kontrolní skupinou, vzhledem k tomu, že pouze Tet2 byla zvýšena po Tuina terapie.
3.1. Genomu-Široký 5 hmc Změny a Distribuce
, Aby prošetřila přesné umístění a rozdělení genomu-široký 5 hmc, hydroxymethylated DNA immunoprecipitation (hMeDIP) následovaný příští generace sekvenování (hMeDIP-seq) byla provedena., Krysy, respektive z kontrolních (n = 3), HI (n = 3), a Tuina (n = 3) skupiny byly obětovány na P31, a genomická DNA levého temporálního laloku kůry byla extrahována pro hMeDIP-seq. Genomu-široký vzor 5 hmC úroveň byla hodnocena počítáním 5 hmC-mapované čte v každé 10 kb bin ze vzorků, kontroly, Tuina, a HI skupiny a pak normalizovány na celkový sekvenční pokrytí . Jak je znázorněno na obrázcích 4(a) -4(c), distribuce 5 hmC v celém genomu ve třech skupinách byla odlišná a poté jsme dále prozkoumali specifické genové oblasti, ve kterých tyto rozdíly existují., Obrázek 4(d) ukazuje, překrývající se funkce normalizované hustoty 5 hmC čte se známou genomickou funkce na definovanými gen těla a CGI (CpG islands) podle UCSC stůl pro RGSC6.0/rn6. Dále, jak je znázorněno na obrázku 4 (e), byly také studovány distribuce 5 hmC v genových tělech a 1 kb nahoru – a po proudu od genových těl., To lze pozorovat od Čísla 4(d) a 4(e) 5 hmC úroveň HI skupiny se lišily od kontrolní skupiny, a Tuina skupinou na 5′ konci genomu těle, zejména v místech, ±500 bp transkripční začátek stránky (TSS) a CGI do 500 bp od TSS.
3.2. Identifikace a Anotace z Odlišně Hydroxymethylated Regionů (DhMRs)
určit konkrétní lokusy vykazují změněné 5 hmC profily, pokračovali jsme identifikovat a charakterizovat konkrétní DhMRs všechny autozomy a pohlavní chromozomy celého genomu., Je zajímavé, že byl velký rozdíl v distribuci hyper-DhMRs a hypo-DhMRs na chromozomu X (Obrázky 5(a)-5(c)). Pro další zkoumání biologického významu nalezených DhMRs byly geny spojené s těmito DhMRs extrahovány pro analýzu obohacení genové ontologie (GO)., Jak je znázorněno na Obrázcích 5(d) a 5(e), JDĚTE obohacení analýzy naznačily, že tyto hypo-DhMRs v HI skupiny bylo zjištěno, že vysoce obohacený na funkční cesty vztahující se k neurovývoji a neuronální funkce, včetně vývojových růst buněk, neuronů projekce prodloužení, pozitivní regulace vývojových růst, vývojové růstu podílí na morfogenezi, a gliových buněk diferenciace.,
na Základě komplexní analýzy hydroxymethylation rozdílové seznamy genů tří skupin, jsme vybrali šest hypo-DhMRs související geny z HI skupiny, které byly spojeny s funkcí nervového systému zkoumat vztah mezi 5 hmC změny a úrovně transkripce těchto genů., Jak se očekávalo, bylo zjištěno, že v souladu se sníženou modifikací 5 hmC v Casd1, Prekg2 a Slc44a1 byly odpovídající úrovně mRNA také významně sníženy ve skupině HI ve srovnání se skupinami control a Tuina (obrázek 5(f))).
4. Diskuse
S obecnou bezpečnost a údajný účinnost, tradiční Čínská medicína (TCM) je ochotně přijal obecné populaci na celém světě. TCM byla široce používána při různých dětských onemocněních , jako je Ewingův sarkom , astma , Gravesova choroba a dětské alergické poruchy ., Mezitím existují také studie, které naznačují, že terapie TCM včetně tuiny, bylinných léků a akupunktury jsou dobře snášeny a mají pozitivní terapeutické účinky na mozkovou obrnu . Vzhledem k slibným klinickým výsledkům a méně vedlejším účinkům přitahuje Čínská masáž Tuina rostoucí zájem o léčbu CP.
Jako nový epigenetické modifikace, 5 hmC slouží nejen jako meziprodukt DNA demetylace procesy, ale také působí jako stabilní epigenetický marker při rozvoji různých onemocnění ., 5 hmC je asi desetkrát více obohaceno v neuronech než v jiných buňkách a jeho dynamická regulace je rozhodující pro postnatální neurodevelopment . Kromě toho byla změna globální úrovně 5 hmC považována za úzce související s mnoha neurodegenerativními poruchami a neurodevelopmentálními chorobami .
podle našich nejlepších znalostí však bylo několik studií zaměřeno na spojení mezi hydroxymethylací DNA a mozkovou obrnou, která se stala inspirací pro náš výzkum., V naší studii, výsledky dot blotting a imunofluorescence ukázala, že globální 5 hmC úrovni ve spánkovém laloku mozkové kůry byla významně snížena po HI zranění, což je v souladu s tím, snížené 5 hmC úrovni v myši ledvin po ischemicko-reperfuzního . Po léčbě Tuinou však byla úroveň 5 hmC ve skupině Tuina vyšší než ve skupině HI., Kromě toho, je známo, že 5 hmC je produkován prostřednictvím oxidace 5 mC tím, Tet proteiny, na základě které jsme zaznamenali hladiny Tet1 a Tet2 proteiny a zjistil, že obě hladiny byly významně sníženy po HI zranění, vzhledem k tomu, že pouze Tet2 protein byl zvýšen po Tuina ošetření. Ve všech, tato zjištění naznačují, že snížená Tet1 a Tet2 vyjádření může přispět k poklesu 5 hmC po HI zranění a Tuina může zvýšit 5 hmC úrovni prostřednictvím zvýšení Tet2 výraz.,
naopak methylace CGI v promotorech byla nalezena kritická při umlčování genů a 5 hmC může hrát roli v genové expresi zprostředkované demethylací DNA . V naší studii skupina HI vykazovala snížené obohacení genomu 5 hmC v CGI v rámci 500 bp TSS ve srovnání s kontrolními a Tuinovými skupinami, zatímco Tuina zvýšila genomovou distribuci 5 hmC., Mezitím, v souladu s předchozím zjištěním, že obohacení 5 hmC v genu může tělo má silnou korelaci se zvýšenou transkripci příslušných genů do neuronů , naše RT-PCR výsledky ukázaly, že deplece 5 hmC změny v Prkg2, Casd1, a Slc44a1 gen byl doprovázen sníženou mRNA těchto genů v HI skupiny., Na základě těchto zjištění bylo uvedeno výše, bylo uvedeno, že 5 hmC změna může hrát rozhodující roli v patogenezi CP přes regulaci transkripce a exprese genů, které souvisí s neuronální funkce a Tuina může vyvolat terapeutické účinky na CP přes modulační 5 hmC.
Více zajímavé je, že bylo zjištěno, že CP a související vývojové poruchy jsou častější viděl u pacientů mužského pohlaví a ženské novorozenecké myš model HI poranění mozku také zobrazí pohlaví nižší výskyt CP , důvod, pro který je stále nejistý., Aby se zabránilo narušení tohoto možného genderově specifického ochranného účinku, byla pro naši studii vybrána pouze samčí krysí mláďata. Pozoruhodné je, že v genomu-široký kruhový mapě (Obrázek 5(a)), velké rozdíly v distribuci hyper-DhMRs a hypo-DhMRs na X chromozomu byla pozorována z porovnání mezi dvěma skupinami v naší studii, což dále potvrzuje spojitost mezi pohlavím a výskytem dětské mozkové obrny., Zejména kvůli omezením naší laboratoře jsme nemohli provádět kontrolu IgG ani generovat vstupní knihovny a Dhmr byly identifikovány přímým porovnáním jedné s druhou spíše než porovnáním se vstupem, který budeme v našich budoucích studiích zlepšovat, aby byl výzkum přesnější.
Kromě toho, JÍT analýzy hypo-DhMRs-spojené genů v HI skupiny ukázaly, že tyto geny jsou vysoce obohacený na více signálních drah vztahující se k neurovývoji a neuronální funkce., V našem experimentu, růstové retardace a vývojových poruch, se objevil v HI skupiny v podobě hubnutí, slabost v končetinách sílu, a několik neuronální reflex poruchy, které byly vylepšeny tím, Tuina ošetření do určité míry. Kromě toho z výsledků testu Morris water maze test a step-down avoidance test Tuina výrazně zlepšila funkce učení a paměti hypoxicko-ischemických potkanů., Tyto výsledky ukazují, že korelace mezi změnou v 5-hydroxymethylcytosine loci a neuronální vývoj a furtherly naznačuje, že Tuina terapie může ovlivnit vývoj mozku a mozkové kognitivní funkce pomocí modulační DNA hydroxymethylation.
V této studii, jsme poskytli genomu-široký 5 hmC mapy kontroly, AHOJ, a Tuina skupin a odhalil změny v DNA hydroxymethylation stav a 5-hmC dynamické změny po Tuina ošetření, které mohou vrhnout světlo na možné terapeutické mechanismus Tuina pro CP.,
dostupnost dat
údaje použité k podpoře zjištění této studie jsou na vyžádání k dispozici od příslušného autora.
střety zájmů
autoři prohlašují, že nedochází ke střetu zájmů.
příspěvky autorů
Yunpeng Zhang a Chao Gao přispěly k této práci stejně.,
Poděkování
Tato práce byla podpořena Národní Přírodní Science Foundation Číny (81774444), Henan Provincie Věda a Technologie, Výzkumný Projekt (182102310403), Čína-Kanada Družstva Klinický Výzkumný Projekt, Provincie Henan Studium v Zahraničí Program (201721), a Henan Provincie Lékařské Vědy a Techniky Výzkumného Projektu (Provinční a Ministerstvo Výstavby Projektu) (201701034).