Zusätzlich zu motorischen und körperlichen Anomalien haben Kinder mit Zerebralparese (CP) häufig eine geistige Behinderung. Als ergänzende und alternative traditionelle Chinesische medizin (TCM) therapie, Chinesische Tuina massage, auch genannt Tuina in China, wurde weit verbreitet in der klinischen behandlung für CP in China für eine lange zeit. Die molekulare Grundlage dafür ist jedoch noch weitgehend unbekannt., In letzter Zeit hat sich gezeigt, dass die DNA-Hydroxymethylierung gegenüber der Umwelt empfindlich ist und bei einigen neurologischen Störungen eine kritische Rolle spielt, während die Forschung, die sich auf die Beziehung zwischen 5 hmC-und Tuina-Therapie bei Zerebralparese konzentriert, mangelhaft ist. In unserer Studie beobachteten wir zuerst, dass Tuina die Lern-und Gedächtnisfunktionen von hypoxisch-ischämischen (HI) Rattenwelpen verbesserte. In der Zwischenzeit ist der hmC-Spiegel des Temporallappen-Kortex im HI neonatalen Rattenmodell im Vergleich zu dem der Ratten in Kontroll-und Tuina-Gruppen signifikant gesunken., Anschließend untersuchten wir mit der hMeDIP-Seq-Methode, ob und wie die DNA-Hydroxymethylierung an der Tuina-Therapie bei Zerebralparese beteiligt ist. Genomische Annotation von DhMRs der Hypo-Hydroxymethylierung der HI-Gruppe an Gene ergab eine Anreicherung in mehreren neurologischen Signalwegen. Darüber hinaus fanden wir heraus, dass die Erschöpfung von 5 hmC-Modifikationen in Genen, die mit der neuronalen Entwicklung verbunden sind, von reduzierten mRNA-Spiegeln dieser Gene begleitet wurde., Zusammengenommen zeigen unsere Ergebnisse, dass Tuina die Expression neuroentwicklungsbezogener Gene regulieren kann, indem der Status der DNA-Hydroxymethylierung geändert wird, wodurch Lern-und Gedächtnisfunktionen der Zerebralparese verbessert werden.
1. Einführung
Hirnverletzungen, die während der perinatalen Phase auftreten, sind eine Hauptursache für erworbene Behinderungen., Das Auftreten von Hirnverletzungen bei Säuglingen korreliert mit mehreren Faktoren, wie Hypoxie-Ischämie, Infektion, oxidativem Stress und Entzündungsreaktion, unter denen Hypoxie-Ischämie (HI) Zerebralparese (CP) induzieren kann, indem perinatale zerebrale Läsionen ausgelöst werden Frühgeburt . CP ist die häufigste chronische Behinderung bei Neugeborenen, die durch motorische und posturale Beeinträchtigungen gekennzeichnet ist und häufig von kognitiven und Lerndefiziten begleitet wird . In grundlagenwissenschaftlichen Studien wurde das HI neonatale Rattenmodell häufig zur Untersuchung der Verhaltensergebnisse und der Pathogenese der Zerebralparese verwendet ., Trotz des großen Fortschritts in CP-Studien bleiben die molekularen Mechanismen, wie Hypoxie-Ischämie zur CP-Entwicklung und-Progression beiträgt, noch unklar.
Die aktuellen Therapien für CP umfassen bis heute hauptsächlich orthopädische Chirurgie, Antispastizitätsmedikamente und verschiedene Arten von motorischen Lerninterventionen , von denen die meisten nur zur Behandlung der mit CP verbundenen Komplikationen dienen und Nebenwirkungen hervorrufen können., Die traditionelle chinesische Medizin (TCM), einschließlich Tuina, Akupunktur und Kräutermedizin, allein oder kombiniert mit der konventionellen Therapie der westlichen Medizin, wurde jedoch in China häufig als alternative Behandlung für CP verwendet . Tuina ist eine uralte Form der medizinischen Massage in der chinesischen Medizin, bei der Fingerdruck auf Akupunkturpunkte ausgeübt wird, die durch Organstörungen sensibilisiert sind . Insbesondere hat Tuina als sicherere und effektivere Intervention offensichtliche Auswirkungen auf die Zerebralparese in der klinischen Praxis gezeigt. Der genaue Mechanismus, wie Tuina auf CP arbeitet, ist jedoch noch nicht geklärt.,
Im Gegenteil, pathogene, umweltsensitive epigenetische Modifikationen sind bereits nachweislich an Neurogenese , Lernen und Gedächtnis sowie synaptischer Plastizität beteiligt . Unter den verschiedenen epigenetischen Modifikationen ist die DNA-Methylierung auf dem fünften Kohlenstoff von Cytosin (5-Methylcytosin, 5 mC) die am weitesten untersuchte epigenetische Modifikation, die eine wichtige Rolle bei der Neuformulierung der Chromatinstruktur, der Transkriptionsunterdrückung und der Zelldifferenzierung spielt ., Darüber hinaus wird die Oxidation von 5 mC zu 5-Hydroxymethylcytosin (5 hmC) durch die Ten-Eleven-Translokationsgenfamilie (TET) als neuartiger Mechanismus zur Entfernung von 5 mC vorgeschlagen , und es wurde vorgeschlagen, dass 5 hmC aufgrund seiner offensichtlichen Anreicherung im Gehirn kritisch für die Aufrechterhaltung der Neuronenstruktur und-funktionen ist . In der Zwischenzeit wird in vielen Studien auch eine 5-hmC-Veränderung festgestellt, die mit neurologischen Störungen in Verbindung gebracht wird , wie Alzheimer-Krankheit , Rett-Syndrom , fragiles X-assoziiertes Tremor/Ataxie-Syndrom , Huntington-Krankheit und Autismus-Spektrum-Störungen ., Diese Beweise lieferten die Grundlage für die Hypothese, dass 5 hmC-Veränderungen eine entscheidende Rolle bei Erkrankungen des Nervensystems spielen können.,
Um das Vorhandensein der Beteiligung der Tuina-Therapie an der Veränderung von 5 hmC in CP zu untersuchen, verwendeten wir eine etablierte chemische Kennzeichnungs-und Affinitätsreinigungsmethode in Verbindung mit Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie, um die möglichen genomweiten 5 hmC-Veränderungen bei HI-Ratten vor und nach der Tuina-Behandlung aufzudecken, um die Beziehung zwischen 5 hmC und Tuina-therapeutischen Wirkungen auf CP zu untersuchen und damit Beweise für die Unterstützung der Anwendung der Tuina-Therapie bei Zerebralparese zu liefern.
2. Materialien und Methoden
2.1., Tiermodell
Alle Experimente wurden von der Ethikkommission für Tierpflege des Jinshan-Krankenhauses der Fudan-Universität genehmigt. Ein modifiziertes Rice-Vannucci-Modell wurde wie zuvor beschrieben verwendet . Das neonatale HI-Modell wurde an männlichen Rattenwelpen von Sprague-Dawley (Slac Laboratory Animal Company, Shanghai, China) am postnatalen Tag 3 (P3) über Ligation der linken Halsschlagader unter 3% iger Isoflurananästhesie durchgeführt. Die Operationszeit für jede Ratte wurde innerhalb von 10 Minuten kontrolliert., Nach der Genesung für 1 Stunde wurden diese Welpen in eine Hypoxiekammer bei 37°C gegeben und 3,5 Stunden lang dem Gasmischer aus 8% O2 und 98% N2 unterworfen. Scheintiere hatten die gleiche Operation, um die gemeinsame Halsschlagader ohne Ligation und Hypoxie freizulegen. Nach der Operation wurden die Rattenwelpen in ihren Heimatkäfig zurückgebracht.
2.2. Tuina-Behandlung
Die Tuina-Behandlung wurde von einem spezialisierten Forscher mit ärztlichem Attest durchgeführt. Vom Tag von P4 bis P31 akzeptierten Rattenwelpen in der Tuina-Gruppe die Tuina-Intervention, die einmal täglich 120 Mal/min für 15 Minuten durchgeführt wird.,f Tuina ist wie folgt: Erstens wurde die Ratte auf die Handfläche der linken Hand des Manipulators gelegt, um sich an die Umgebung anzupassen; Zweitens benutzte der Manipulator den Mittelfinger seiner rechten Hand, um die Ratte dreimal sanft vom Hals bis zum Schwanz zu reiben, um ihre Muskeln zu entspannen; Drittens wurde Tuina durch aufeinanderfolgendes Reiben, Kneten und Ein-Finger-Drücken entlang der Wirbelsäule der Ratten von oben nach unten und von innen nach außen an Dorsum-und ambilateralen Bändern sowie den Muskeln entlang des Du-Meridians und des Blasenmeridians der Ratte in Bezug auf verwandte traditionelle chinesische Medizin durchgeführt. (TCM) funktioniert.,
2.3. Aufrichtungsreflexes
Aufrichtenden reflex von Neugeborenen Ratten wurde bewertet von P5 auf P11, wie zuvor beschrieben . Während dieses Tests wurden die Rattenwelpen in Rückenlage auf einer gereinigten ebenen Fläche platziert und die Zeit für das Erreichen dieser Welpen in Bauchlage mit allen vier Pfoten gemessen.
2.4. Gangreflex
Rattenwelpen wurden in die Mitte eines weißen abgerundeten Kartons (13 cm Durchmesser) gelegt, und der Tag, an dem sie sich mit beiden Vorderbeinen vom Kreis bewegten, wurde aufgezeichnet .
2.5., Schrägplattentest
Dieser Test wurde verwendet, um die Festigkeit der Gliedmaßen zu messen, indem der maximale Neigungswinkel aufgezeichnet wurde, auf den die Rattenwelpen am Tag von P21 noch greifen können, wie in Abbildung 1(b) gezeigt . Während dieses Tests wurden die Ratten nach rechts oder links gestellt und der Winkel der Ebene wurde alle fünf Sekunden um 5° erhöht, um den maximalen Neigungswinkel zu bestimmen, den die Ratte noch halten konnte .
2.6. Step-Down Avoidance Test
Dieser Test wurde implementiert, um die Speichererhaltung zu messen . Eine Ratte wurde sanft auf eine zylindrische Isolationsplattform gelegt (4.,5 cm im Durchmesser und in der Höhe) in einer Konditionierungskammer zur Anpassung an die Umgebung für 3 min. Sobald die Ratte die Plattform hinuntersteigt, wird sie sofort elektrifiziert. In der 5-Minuten-Trainingseinheit (P26), die Ratten wurden trainiert, um zu springen zurück auf die Plattform, zu vermeiden die elektrische stimulation. In den Testsitzungen (24 h nach dem Training, d. H. P27) wurden die Latenzzeit (die Zeit für den ersten Schritt der Ratten von der Plattform) und die Anzahl der Fehler (Häufigkeit des Rücktritts der Ratten von der Plattform) aufgezeichnet.
2.7., Morris Water Maze (MWM) Test
Um räumliches Lernen und Gedächtnis zu bewerten, wurde der Morris Water Maze Test für 5 Tage wie zuvor beschrieben durchgeführt . Das Wasserlabyrinth (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, China) wurde in vier Quadranten unterteilt, und eine Plattform (5 cm Durchmesser) wurde 1 cm unter der Wasseroberfläche in einem Quadranten platziert. In den Trainingseinheiten (P27–P30) wurden alle Ratten viermal täglich an vier aufeinanderfolgenden Tagen trainiert und durften die versteckte Plattform innerhalb von 60 s finden., Wenn die Ratte die Plattform nicht innerhalb von 60 s fand, wurde sie sanft zur Plattform geführt und durfte 30 s darauf bleiben, bevor sie zurück in den Käfig geschickt wurde. Am Tag des Spatial Probe Trial (P31) wurde die Plattform entfernt und die Ratten aus der gleichen Position wie in den Trainingseinheiten in das Wasser entlassen, das der Poolwand zugewandt war. Anschließend wurden die Bewegungsspuren und die Anzahl der Bahnsteigübergänge aufgezeichnet.
2.8., Dot Blotting
Nach Abschluss der oben genannten Tests wurden die Rattenwelpen auf P31 geopfert und ihr Gehirn wurde seziert, um die gesamte DNA des linken temporalen Kortex durch ein QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Deutschland) zu sammeln. 2,5 µL genomische DNA (100 ng / µL) wurde auf Nylonmembranen entdeckt, gefolgt von 30 min Backen bei 80°C, um DNA zu vernetzen . Nach Blockierung mit 5% fettfreier Milch für 1 h bei Raumtemperatur wurde die Membran mit polyklonalem 5-hmC-Antikörper (1 : 1000-Verdünnung, Wirkstoff, USA, Kat. Nein., 39769) bei 4°C über Nacht und der Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierte sekundäre Antikörper wurde verwendet, um am nächsten Tag zu sondieren. Die Dot-Blot-Membran wurde mit 0,02% Methylenblau (MB) gefärbt, um eine gleichmäßige Belastung zu gewährleisten.
2.9. Hydroxymethylierte DNA-Immunpräzipitationsanalyse (hMeDIP) und Hochdurchsatzsequenzierung
Genomische DNA wurde aus dem linken temporalen Kortex von Rattenwelpen extrahiert (Kontrolle: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) und auf 200-350 Basenpaare (bp) repliziert. Und die DNA-Fragmente wurden am Ende repariert; A-Tailed und Illumina Adapter wurden ligiert., Anschließend wurde adapterligierte DNA denaturiert und mit 5 hmC-Antikörpern inkubiert (Active Motif, USA, Kat. No. 39769) bei 4°C über Nacht. Antikörper-DNA-Komplexe wurden mit Protein-A/G-Perlen eingefangen. Die immunpräzipitative DNA wurde gereinigt und einer Hochdurchsatzsequenzierung am Illumina HiSeq3000-System (Illumina, USA) unterzogen .
2.10. Mapping von Sequenzierungsdaten und Bioinformatik
Die Verarbeitung von Sequenzierungsdaten wurde wie zuvor beschrieben durchgeführt . FASTQ-Sequenzdateien nach biologischen Duplikationen wurden an UCSC Rattenreferenzgenom (RGSC6.0/rn6) ausgerichtet ., Einzigartige, nichtduplizierte Lesevorgänge wurden für den Peak-Aufruf und die Annotation durch hypergeometrische Optimierung der Motivanreicherung (HOMER) verwendet . 5-hmC-Anreicherungsspitzen wurden unter Verwendung einer modellbasierten Analyse der ChIP-Seq (MACS)-Software bestimmt . Und differentiell hydroxymethylierte Regionen (DhMRs) wurden unter allen Paaren von 5-hmC-angereicherten Proben identifiziert, indem eine Probe in jeder Richtung direkt mit einer anderen verglichen wurde . Gen Ontology (GO) Analysen wurden mit dem DAVID durchgeführt .
2.11. Quantitative RT-PCR
Die gesamte RNA wurde aus dem Kortex des linken Temporallappens extrahiert., Die umgekehrte Transkription von cDNA wurde mit dem PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japan) durchgeführt. Quantitative RT-PCR-Reaktionen wurden an 7500 Echtzeit-PCR-Systemen (Applied Biosystems, USA) unter Verwendung von SYBR green (Takara, Japan) durchgeführt. β-Aktin wurde als interne Kontrolle verwendet, und die relative Expression des Zielgens wurde durch die 2−ΔΔCT-Methode bestimmt., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
Der isolierte Kortex des linken Temporallappens wurde mit eiskaltem Proteinlysat versetzt und bei 12000 r/min für 20 min bei 4°C zentrifugiert.Proteinproben wurden durch Elektrophorese mittels SDS-PAGE abgetrennt und auf PVDF-Membranen übertragen (Millipore, USA). Nach Blockierung mit 5% fettfreier Milch für 2 h bei Raumtemperatur wurden die Membranen mit den primären Antikörpern bei 4°C über Nacht inkubiert und anschließend mit HRP-konjugierten sekundären IgG-Antikörpern inkubiert. Der primäre Antikörper verwendet, die hier enthalten anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. Nein., 191698), anti-Tet2 (1 : 1000, Millipore, USA, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. No. 110767), und anti-β-tubulin (1 : 2000, Cell Signaling Technology, USA, Cat. #2128). Die Membranen wurden dann unter Verwendung der ECL-Detektion entwickelt und die Signale wurden mit dem Chemilumineszenz-Bildgebungssystem Tanon-5200 (Tanon, Shanghai, China) detektiert. Die Proteinspiegel wurden mittels Image J Software (NIH, Bethesda, USA) analysiert und auf den entsprechenden β-Tubulinspiegel normalisiert.
2.13., Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie
Rattenwelpen wurden auf P31 geopfert, und ihre Herzen wurden mit 0,9% Kochsalzlösung, gefolgt von 4% Paraformaldehyd (PFA), perfundiert. Nach der Perfusion wurden die Gehirne über Nacht in 4% PFA seziert und fixiert, gefolgt von der Einbettung in Paraffin und der Herstellung in serielle Abschnitte von 5 µm. Nach Mikrowellen-Antigen-Retrieval in Zitronensäurepuffer bei 95°C wurden unspezifische Stellen mit 5% Rinderserumalbumin (BSA) für 1 h bei Raumtemperatur blockiert. Als nächstes wurden die Gehirnabschnitte mit 5 hmC-Primärantikörpern inkubiert (1 : 1000, Aktives Motiv, USA, Kat. Nein., 39769) über Nacht bei 4°C gefolgt von Inkubation mit dem sekundären Antikörper (1 : 200, Life Technology, USA) 1 h bei 37°C. 4′,6-Diamino-2-phenylindol (DAPI) wurde für die nukleare Immunfluoreszenzfärbung verwendet, und die Immunfluoreszenzbilder wurden visualisiert und mit einem konfokalen Mikroskop (Leica sp5, Deutschland) aufgenommen.
2.14. Statistische Analyse
Alle Daten wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittels (SEM) ausgedrückt und mit SPSS analysiert., Eine Einweganalyse der Varianz (ANOVA) wurde angewendet, um die Unterschiede zwischen den 3 Gruppen zu bestimmen, gefolgt von einem nichtparametrischen T-Test und einem Tukey-signifikanten Differenztest. Wert <0.05 wurde als statistisch signifikant.
3. Ergebnisse
Tuina verbesserte Gewichtsverlust, Schwäche der Gliedmaßen Festigkeit und Störungen der neurologischen Reflexe, die durch HI.,
Das Körpergewicht von Rattenwelpen wurde von P4 bis P28 gemessen, und es wurde festgestellt, dass von P22 bis P28 das Körpergewicht der Ratten in der Tuina-Gruppe (n = 11) signifikant zunahm im Vergleich zur HI-Gruppe (n = 11; Abbildung 1(a))). Die Ergebnisse des Schrägflächentests zeigten, dass die maximalen Winkel in der Tuina-Gruppe höher waren als in der HI-Gruppe (Abbildung 1(b)), was auf eine Verbesserung der Schwäche der Gliedmaßenstärke in der Tuina-Gruppe hindeutete., Die Ergebnisse der Reflexe des Nervensystems waren wie folgt: Im Gangreflextest begannen sich die Rattenwelpen in der HI-Gruppe mit beiden Vordergliedern signifikant später als in der Kontroll-und Tuina-Gruppe vom Kreis zu entfernen (Abbildung 1(c))). Im rechten Reflextest brauchten die Ratten in der Tuina-Gruppe kürzere Zeit, um sich zu rechtfertigen als die Ratten in der HI-Gruppe von P7 bis P11 (Abbildung 1(d)).
Tuina förderte Lern – und Gedächtnisfunktionen von hypoxisch-ischämischen Rattenwelpen.,
Morris water maze-test-und step-down-test wurden durchgeführt, um zu evaluieren, die Lern-und Gedächtnisfähigkeit der Ratten. Wie in Abbildung 2(a) gezeigt, zeigen die Bewegungsspuren am Sondentesttag des MWM-Tests, dass die Anzahl der Bahnsteigübergänge der HI-Gruppe signifikant geringer war als die der Kontrollgruppe und der Tuina-Gruppe (Abbildung 2(b))). Im Step-Down-Test zeigten die HI-Ratten eine signifikant kürzere Latenzzeit und mehr Fehler im Vergleich zu Kontroll-und Tuina-Ratten (Abbildungen 2(c) und 2(d)).
Tuina erhöhte 5 hmC – und Tet2-Spiegel in der Großhirnrinde von HI-Ratten.,
Um zu untersuchen, ob das Niveau von 5 hmC während der CP-Entwicklung beeinflusst wurde, führten wir Dot-Blot-Tests durch und beobachteten, dass der 5 hmC-Spiegel von HI-Ratten im Vergleich zu dem der Kontrolle signifikant abnahm, während dieses Niveau nach Tuina teilweise erhöht wurde (; Abbildung 3(a))). In der Zwischenzeit zeigte die Immunfluoreszenzfärbung die Verschmelzung von 5 hmC-und DAPI-Färbung und HI führte zu einer Abnahme der genomischen 5 hmC im linken temporalen Kortex, während die Tuina-Behandlung das 5 hmC-Niveau bis zu einem gewissen Grad wiederherstellte (Abbildung 3(b))), was in Übereinstimmung mit den Ergebnissen des Punktblotzens war., Darüber hinaus zeigte die HI-Gruppe, wie in den Abbildungen 3(c) und 3(d) gezeigt, eine verringerte Tet1-und Tet2-Expression im Vergleich zur Kontrollgruppe, während nur Tet2 nach Tuina-Therapie erhöht war.
3.1. Genomweite 5-hmc-Veränderung und-verteilung
Um den genauen Ort und die Verteilung von genomweiter 5-hmc zu untersuchen, wurde eine hydroxymethylierte DNA-Immunpräzipitation (hMeDIP) durchgeführt, gefolgt von einer Sequenzierung der nächsten Generation (hMeDIP-seq)., Die Ratten aus den Kontrollgruppen (n = 3), HI (n = 3) und Tuina (n = 3) wurden auf P31 geopfert, und die genomische DNA des linken Temporallappenkortex wurde für hMeDIP-seq extrahiert. Das genomweite Muster des 5-hmC-Levels wurde ausgewertet, indem 5 hmC-Mapped-Lesevorgänge in jedem 10-kb-Behälter aus den Proben der Kontroll -, Tuina-und HI-Gruppen gezählt und dann auf die gesamte Sequenzierungsabdeckung normalisiert wurden . Wie in Abbildungen 4(a)-4(c) gezeigt, war die Verteilung der genomweiten 5 hmC-Lesevorgänge in den drei Gruppen unterschiedlich, und dann untersuchten wir weiter die spezifischen Genregionen, in denen diese Unterschiede bestehen., Abbildung 4 (d) zeigt die überlappenden Merkmale der normalisierten Dichte von 5 hmC-Lesevorgängen mit den bekannten genomischen Merkmalen an definierten Genkörpern und CGI (CpG-Inseln) gemäß der UCSC-Tabelle für RGSC6.0/rn6. Des Weiteren wurden, wie in Abbildung 4(e) gezeigt, auch die Verteilungen von 5 hmC an Genkörpern und 1 kb auf – und abwärts von Genkörpern untersucht., Es kann aus den Abbildungen 4(d) und 4(e) beobachtet werden, dass sich der 5-hmC-Spiegel der HI-Gruppe von denen der Kontrollgruppe und der Tuina-Gruppe am 5-Ende des genomischen Körpers unterschied, insbesondere an den Stellen von ±500 bp der transkriptionellen Startstellen (TSS) und der CGI innerhalb von 500 bp von TSS.
3.2. Identifizierung und Annotation von differentiell hydroxymethylierten Regionen (DhMRs)
Um die spezifischen Loci mit veränderten 5 hmC-Profilen zu lokalisieren, identifizierten und charakterisierten wir die spezifischen DhMRs aller Autosomen und Geschlechtschromosomen im gesamten Genom., Interessanterweise gab es große Unterschiede in der Verteilung von hyper-DhMRs und hypo-DhMRs auf dem X-Chromosom (Abbildungen 5(a)-5(c)). Um die biologische Bedeutung der gefundenen DhMRs weiter zu untersuchen, wurden die mit diesen DhMRs assoziierten Gene für die Gen Ontology (GO) Enrichment Analysis extrahiert., Wie in den Abbildungen 5(d) und 5(e) gezeigt, zeigte die GO-Anreicherungsanalyse, dass diese Hypo-DhMRs in der HI-Gruppe auf den funktionellen Wegen im Zusammenhang mit Neuroentwicklung und neuronalen Funktionen, einschließlich Entwicklungszellwachstum, Neuronenprojektionsverlängerung, positiver Regulation des Entwicklungswachstums, Entwicklungswachstum, das an der Morphogenese beteiligt ist, und Gliazelldifferenzierung, hoch angereichert gefunden wurden.,
Basierend auf der umfassenden Analyse von Hydroxymethylierungs-Differentialgenenlisten der drei Gruppen haben wir sechs hypo-DhMRs-assoziierte Gene aus der HI-Gruppe ausgewählt, die alle mit den Funktionen des Nervensystems assoziiert waren, um die Beziehung zwischen 5 hmC-Veränderungen und Transkriptionsniveaus dieser Gene zu untersuchen., Wie zu erwarten war, wurde festgestellt, dass gemäß der reduzierten 5-hmC-Modifikation in Casd1, Prkg2 und Slc44a1 auch die entsprechenden mRNA-Spiegel in der HI-Gruppe im Vergleich zu denen in Kontroll-und Tuina-Gruppen signifikant verringert waren (Abbildung 5(f))).
4. Diskussion
Mit allgemeiner Sicherheit und angeblicher Wirksamkeit wird die traditionelle chinesische Medizin (TCM) von der Allgemeinbevölkerung auf der ganzen Welt leicht akzeptiert. TCM wurde bei verschiedenen pädiatrischen Erkrankungen wie Ewing-Sarkom, Asthma , Graves-Krankheit und pädiatrischen allergischen Erkrankungen weit verbreitet angewendet ., Inzwischen gibt es auch Studien, die darauf hinweisen, dass TCM-Therapien wie Tuina, pflanzliche Arzneimittel und Akupunktur gut verträglich sind und positive therapeutische Wirkungen auf die Zerebralparese haben . Aufgrund der vielversprechenden klinischen Ergebnisse und weniger Nebenwirkungen hat die chinesische Tuina-Massage ein wachsendes Interesse an der Behandlung von CP geweckt.
Als neue epigenetische Modifikation dient 5 hmC nicht nur als Zwischenprodukt von DNA-Demethylierungsprozessen, sondern wirkt auch als stabiler epigenetischer Marker bei der Entwicklung verschiedener Krankheiten., 5 hmC ist in Neuronen etwa zehnmal stärker angereichert als in anderen Zellen, und seine dynamische Regulation ist für die postnatale Neuroentwicklung von entscheidender Bedeutung . Darüber hinaus wurde die Veränderung des globalen 5-hmC-Spiegels in engem Zusammenhang mit vielen neurodegenerativen Störungen und Neuroentwicklungserkrankungen betrachtet .
Nach bestem Wissen haben sich jedoch nur wenige Studien auf den Zusammenhang zwischen DNA-Hydroxymethylierung und Zerebralparese konzentriert, der zur Inspiration für unsere Forschung wurde., In unserer Studie zeigten die Ergebnisse von Punktblotting und Immunfluoreszenz, dass der globale 5-hmC-Spiegel in der Hirnlappenrinde nach HI-Verletzung signifikant verringert war, was mit dem reduzierten 5-hmC-Spiegel in der Maus übereinstimmt Niere nach Ischämie-Reperfusion . Nach der Tuina-Behandlung war der hmC-Spiegel in der Tuina-Gruppe jedoch höher als in der HI-Gruppe., Darüber hinaus ist bekannt, dass 5 hmC durch Oxidation von 5 mC durch Tet-Proteine produziert wird, auf deren Grundlage wir die Spiegel von Tet1-und Tet2-Proteinen detektierten und feststellten, dass beide Spiegel nach HI-Verletzung signifikant verringert waren, während nur Tet2-Protein nach Tuina-Behandlung erhöht wurde. Insgesamt implizieren diese Ergebnisse, dass die reduzierte Tet1-und Tet2-Expression zur Abnahme von 5 hmC nach HI-Verletzung beitragen kann und Tuina den 5-hmC-Spiegel durch Verbesserung der Tet2-Expression erhöhen kann.,
Im Gegenteil, die CGI-Methylierung in Promotoren wurde bei der Gen-Silencing als kritisch befunden, und 5 hmC kann eine Rolle bei der durch DNA-Demethylierung vermittelten Genexpression spielen . In unserer Studie zeigte die HI-Gruppe eine verringerte Anreicherung von genomweiter 5 hmC in CGI innerhalb von 500 bp TSS im Vergleich zu Kontroll-und Tuina-Gruppen, während Tuina die genomweite Verteilung von 5 hmC erhöhte., In Übereinstimmung mit den vorherigen Erkenntnissen, dass die Anreicherung von 5 hmC im Genkörper eine starke Korrelation mit der erhöhten Transkription der betroffenen Gene in Neuronen haben kann , zeigten unsere RT-PCR-Ergebnisse, dass die Erschöpfung der 5 hmC-Modifikation in Prkg2, Casd1 und Slc44a1-Gen wurde von den reduzierten mRNA-Spiegeln dieser Gene in der HI-Gruppe begleitet., Basierend auf all diesen oben genannten Befunden wurde angezeigt, dass die 5-hmC-Modifikation eine kritische Rolle bei der Pathogenese von CP spielen kann, indem sie die Transkription und Expression der Gene reguliert, die mit neuronalen Funktionen zusammenhängen, und Tuina kann therapeutische Wirkungen auf CP durch Modulieren von 5 hmC erzeugen.
Interessanterweise wurde festgestellt , dass CP und verwandte Entwicklungsstörungen häufiger bei männlichen Patienten auftreten und das weibliche neonatale Mausmodell einer HI-Hirnverletzung auch geschlechtsspezifisch ein geringeres Auftreten von CP zeigte, dessen Grund noch ungewiss ist., Um die Störung durch diese möglichen geschlechtsspezifischen Schutzeffekte zu vermeiden, wurden nur männliche Rattenwelpen für unsere Studie ausgewählt. Bemerkenswerterweise wurden in der genomweiten kreisförmigen Karte (Abbildung 5(a)) große Unterschiede in der Verteilung von Hyper-DhMRs und Hypo-DhMRs auf dem X-Chromosom aus dem Vergleich zwischen zwei beliebigen Gruppen in unserer Studie beobachtet, was die Korrelation zwischen Geschlecht und dem Auftreten von Zerebralparese weiter bestätigt., Insbesondere aufgrund der Einschränkungen unseres Labors konnten wir die IgG-Kontrolle nicht durchführen oder die Eingabebibliotheken generieren, und DhMRs wurden identifiziert, indem sie direkt miteinander verglichen wurden, anstatt sie mit dem Input zu vergleichen, den wir in unseren zukünftigen Studien verbessern werden, um die Forschung genauer zu machen.
Darüber hinaus zeigten GO-Analysen hypo-DhMRs-assoziierter Gene in der HI-Gruppe, dass diese Gene in hohem Maße an mehreren Signalwegen im Zusammenhang mit Neuroentwicklung und neuronalen Funktionen angereichert sind., In unserem experiment, Wachstumsretardierung und neuroentwicklungsstörungen erschien in der HI-Gruppe in form von Gewichtsverlust, Schwäche in den Gliedmaßen Festigkeit, und mehrere neuronalen reflex Erkrankungen, die optimiert wurden durch die Tuina-Behandlung zu einem gewissen Grad. Darüber hinaus verbesserte Tuina anhand der Ergebnisse des Morris Water Maze-Tests und des Step-Down-Vermeidungstests die Lern-und Gedächtnisfunktionen von hypoxisch-ischämischen Ratten signifikant., Diese Ergebnisse zeigen die Korrelation zwischen der Veränderung der 5-Hydroxymethylcytosinloci und der neuronalen Entwicklung und legen nahe, dass die Tuina-Therapie die Entwicklung des Gehirns und die kognitiven Funktionen des Gehirns durch Modulation der DNA-Hydroxymethylierung beeinflussen kann.
In der vorliegenden Studie lieferten wir genomweite 5-hmC-Karten der Kontroll -, HI-und Tuina-Gruppen und zeigten eine Veränderung des DNA-Hydroxymethylierungsstatus und eine dynamische 5-hmC-Änderung nach der Tuina-Behandlung, die Aufschluss über den möglichen therapeutischen Mechanismus von Tuina für CP geben kann.,
Datenverfügbarkeit
Die zur Unterstützung der Ergebnisse dieser Studie verwendeten Daten sind auf Anfrage beim entsprechenden Autor erhältlich.
Interessenkonflikte
Die Autoren erklären, dass es keine Interessenkonflikte gibt.
Beiträge der Autoren
Yunpeng Zhang und Chao Gao trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.,
Danksagungen
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (81774444), dem Henan Province Science and Technology Research Project (182102310403), dem China-Canada Cooperative Clinical Research Project, dem Henan Province Study Abroad Program (201721) und dem Henan Province Medical Science and Technology Research Project (Provincial and Ministry Construction Project) (201701034) unterstützt.