La carrera actoral de Chalke comenzó a los ocho años cuando comenzó a aparecer en producciones de teatro musical. A los 12 años, se convirtió en reportera en el programa infantil Canadiense KidZone. En 1993, asumió el papel de Rebecca Conner-Healy en Roseanne después de que Lecy Goranson dejara la serie; Chalke hizo un cameo como un personaje diferente en el episodio de Roseanne «Halloween: The Final Chapter» (#178, originalmente emitido el 31 de octubre de 1995) después de que Goranson regresara. Chalke más tarde regresó al papel de Becky después de que Goranson se fuera por segunda vez., Después de que el programa terminó, Chalke regresó brevemente a Canadá, donde protagonizó el drama televisivo de CBC Nothing Too Good for a Cowboy (1998-1999).
en 2001, fue elegida como el Dr. Elliot Reid en la serie de comedia de NBC Scrubs y sería miembro del elenco para las nueve temporadas hasta que la serie terminó su carrera en 2010. Ha aparecido en varios largometrajes, incluyendo Ernest Goes To School y Cake. Apareció en The ‘Bu with the Lonely Island del Canal 101, Una parodia del exitoso programa The O. C., Pero fue acreditada como»Pamela Fenton»., En 2007, apareció como un personaje secundario en Chaos Theory, protagonizada por su compatriota canadiense Ryan Reynolds. En 2008, Chalke se convirtió en el portavoz de una línea de ropa interior femenina de Hanes que incluía una serie de comerciales dirigidos por su co-estrella de Scrubs Zach Braff. En 2008 y 2009, hizo apariciones en la sitcom de CBS How I Met Your Mother como Stella Zinman. A principios de 2011, protagonizó la serie de televisión de CBS Mad Love, una comedia romántica que debutó como reemplazo de mitad de temporada y fue cancelada después de que solo se produjera una temporada.,
Chalke fue firmado por el ex productor ejecutivo de Scrubs Bill Lawrence para interpretar el interés amoroso de Bobby Cobb en la serie Cougar Town. Ella apareció en múltiples episodios en la tercera temporada. Chalke protagonizó la serie de comedia de ABC How To Live with Your Parents (for the Rest of Your Life), que se estrenó el 3 de abril de 2013, y que fue cancelada un mes después. Interpretó a Polly, una madre divorciada soltera y muy tensa que se encontró mudándose con sus padres (Elizabeth Perkins y Brad Garrett) debido a la recesión económica., También en 2013, interpretó a una madre frenética llamada Casey Hedges en el episodio de la Temporada 9 de Grey’s Anatomy «Can’t Fight This Feeling». Chalke también es la voz de Beth en el programa Rick y Morty.
el 28 de abril de 2017, se anunció que un renacimiento de Roseanne estaba en las obras, y que la mayoría del elenco original y algunos de los productores regresarían para la serie de renacimiento. El 16 de mayo de 2017, se confirmó que ocho episodios de la serie fueron aprobados por ABC y se emitirían a mitad de temporada en 2018 con Chalke regresando, pero interpretando un papel diferente a Becky Conner., Después de su cancelación, más tarde regresó para su serie spin-off, the Conners.