absztrakt
a motoros és testtartási rendellenességek mellett az agyi bénulásban (CP) szenvedő gyermekek gyakran értelmi fogyatékossággal rendelkeznek. Mint kiegészítő és alternatív hagyományos kínai orvoslás (TCM) terápia, Kínai Tuina masszázs, más néven Tuina Kínában, széles körben alkalmazzák a klinikai kezelés CP Kínában hosszú ideig. Ennek molekuláris alapja azonban továbbra is nagyrészt ismeretlen., A közelmúltban kimutatták, hogy a DNS-hidroximetiláció érzékeny a környezetre, és kritikus szerepet játszik egyes neurológiai rendellenességekben, míg az agybénulás 5 hmC és Tuina terápiája közötti kapcsolatra összpontosító kutatás hiányos. Tanulmányunkban először megfigyeltük, hogy a Tuina javította a hypoxiás-ischaemiás (HI) patkány kölykök tanulási és memóriafunkcióit. Eközben a Hi újszülött patkánymodellben a temporális lebeny kéreg 5 hmC szintje jelentősen csökkent a kontroll-és Tuina-csoportokban lévő patkányok szintjéhez képest., Ezután a HMEDIP-Seq módszert használtuk annak feltárására, hogy a DNS-hidroximetiláció részt vesz-e az agyi bénulás Tuina terápiájában. A HI csoport hipo-hidroximetilációjának Dhmr-jeinek genomikai annotációja génekre dúsítást mutatott több neurodevelopmentális jelátviteli úton. Ezenkívül azt találtuk, hogy a neuronális fejlődéshez kapcsolódó gének 5 hmC-módosításának kimerülését ezeknek a géneknek a csökkent mRNS-szintje kísérte., Eredményeink együttesen azt mutatják, hogy a Tuina a DNS-hidroximetiláció állapotának megváltoztatásával szabályozhatja a neurodevelopmentációval kapcsolatos gének expresszióját, ezáltal javítva az agyi bénulás tanulási és memóriafunkcióit.
1. Bevezetés
A perinatális időszakban bekövetkező agyi sérülés a szerzett fogyatékosság egyik fő oka., Az esemény, agyi sérülés, a csecsemők összefügg több tényezők, mint például a hypoxia-ischemia, fertőzés, oxidatív stressz, gyulladásos válasz amelyek között hypoxia-ischemia (HI) idézhet bénulás (CP) kiváltó perinatális agyi elváltozások a koraszülött . A CP a leggyakoribb újszülöttkori krónikus fogyatékosság, amelyet motoros és poszturális károsodások jellemeznek, és gyakran kognitív és tanulási hiányok kísérik . Az alapvető tudományos vizsgálatokban a HI újszülött patkány modellt széles körben használják az agyi bénulás viselkedési eredményeinek és patogenezisének feltárására ., Annak ellenére, hogy a nagy előrelépés a CP vizsgálatok, a molekuláris mechanizmusok hogyan hypoxia-ischaemia hozzájárul a CP fejlődését és progresszióját továbbra is tisztázatlan.
A mai napig a CP jelenlegi terápiái elsősorban ortopédiai sebészetet, görcsoldó gyógyszereket és különféle motoros tanulási beavatkozásokat tartalmaznak, amelyek többsége csak a CP-vel kapcsolatos szövődmények kezelésére szolgál, és mellékhatásokat okozhat., Azonban a hagyományos kínai orvoslás (TCM), beleértve Tuina, akupunktúra, gyógynövény, önmagában vagy kombinálva a hagyományos terápia a nyugati orvoslás, széles körben használják, mint egy alternatív kezelés a CP Kínában . A Tuina a kínai orvoslás orvosi masszázsának ősi formája, ujjnyomással az akupontokra, amelyeket szervi károsodás érzékennyé tesz . Nevezetesen, Tuina, mint biztonságosabb és hatékonyabb beavatkozás, nyilvánvaló hatást gyakorolt az agyi bénulásra a klinikai gyakorlatban. A Tuina CP-n történő működésének pontos mechanizmusa azonban még nem tisztázott.,
éppen ellenkezőleg, patogenikusan, környezetérzékeny epigenetikai módosítások már bizonyítottan részt vesznek a neurogenezisben , a tanulásban és a memóriában, valamint a szinaptikus plaszticitásban . A különböző epigenetikai módosítások közül a citozin ötödik szénén (5-metilcytozin, 5 mC) végzett DNS-metiláció a legszélesebb körben vizsgált epigenetikai módosítás, amely fontos szerepet játszik a kromatinszerkezet remoldingjában, transzkripciós szuppresszióban és a sejtek differenciálásában ., Továbbá, oxidációs 5 mC be az 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) a tíz-tizenegy transzlokáció (TET) gén család javasolt, mint egy regény mechanizmus eltávolítása 5 mC , 5 hmC javasolta, hogy a kritikus a fenntartó a neuron felépítése, funkciói miatt a nyilvánvaló gazdagodás az agyban . Eközben, 5 hmC megváltoztatása is azonosított sok tanulmányok összefüggésbe hozható, idegrendszeri betegségek, például az Alzheimer-kór , Rett-szindróma , törékeny X-kapcsolódó tremor/ataxia szindróma , Huntington-kór , az autizmus spektrum zavarok ., Ezek a bizonyítékok biztosították annak a hipotézisnek az alapját, hogy az 5 hmC-változás kritikus szerepet játszhat az idegrendszeri betegségben.,
ahhoz, Hogy fedezze fel a jelenléte bevonása Tuina terápia a megváltoztatása 5 hmC CP, alkalmaztunk egy meghatározott kémiai címkézés, affinitás tisztítási módszer párosul magas áteresztőképességű szekvenálás technológia, hogy felfedje a lehetséges genom-wide 5 hmC változások SZIA patkányok előtt, illetve után Tuina kezelés annak érdekében, hogy keresni a kapcsolat 5 az sztk-ba, majd Tuina terápiás hatások a CP, ezáltal bizonyíték arra, hogy támogassa a kérelmet a Tuina terápia bénulás.
2. Anyagok és módszerek
2.1., Állatmodell
az összes kísérletet a Jinshan Kórház állatgondozási Etikai Bizottsága hagyta jóvá, amely a Fudan Egyetemen társult. A módosított Rice-Vannucci modellt a korábban leírtak szerint használták. Az újszülött HI modellt Sprague-Dawley hím patkány kölykökön (Slac Laboratory Animal Company, Sanghaj, Kína) végezték a szülés utáni napon 3 (P3) a bal közös carotis artéria 3% izoflurán érzéstelenítés alatt történő ligálásával. Az egyes patkányok műtéti idejét 10 percen belül ellenőrizték., Az 1 órán át tartó gyógyulás után ezeket a kölyköket 37°C-on hipoxia kamrába helyezték, és 3,5 órán keresztül 8% O2-t és 98% N2-t tartalmazó gázkeverőbe helyezték. A kamuállatoknak ugyanaz a műtétük volt, hogy a közös nyaki artériát ligáció és hipoxia nélkül feltárják. A műtét után a patkány kölykök visszatértek otthoni ketrecükbe.
2.2. Tuina kezelés
a Tuina kezelést egy speciális kutató végezte, aki szakorvosi bizonyítvánnyal rendelkezik. A P4-től a P31-ig terjedő naptól kezdve a Tuina csoport patkány kölykei elfogadták a Tuina beavatkozást, amelyet 120-szor/perc 15 percig, naponta egyszer hajtanak végre.,f Tuina a következők: először is, a patkány került a palm a manipulátor bal keze alkalmazkodni a környezet; másodszor, a manipulátor használják, a középső ujj a jobb kéz, hogy finoman dörzsölje a patkány nyaktól a farok háromszor pihenni az izmokat; harmadszor, Tuina végzett egymást követő, dörzsölés, gyúrás, egy ujjal nyomja a gerinc mentén a patkányok fentről lefelé, belülről kifelé, a dorsum, valamint ambilateral szalagok, valamint az izmok mentén du meridian, illetve a húgyhólyag meridián a patkány hivatkozással kapcsolódó hagyományos Kínai orvoslás (TCM) működik.,
2.3. Righting Reflex
Righting reflex újszülött patkányok értékelték a P5 P11, mint korábban leírtuk . A vizsgálat során a patkánykölyköket egy letisztított, sík felületen fekvő helyzetbe helyezték, és azt az időt mérték, hogy ezek a kölykök mind a négy mancsukkal elérjék a hason fekvő pozíciót.
2.4. A járási Reflex
patkány kölyköket egy fehér, lekerekített karton (13 cm átmérőjű) közepére helyezték, és azt a napot, amikor mindkét mellső végtaggal eltávolodtak a körről, rögzítették .
2, 5., Ferde Síkteszt
ezt a tesztet a végtag szilárdságának mérésére használták, a lejtés maximális szögének rögzítésével, amelyre a patkány kölykök még mindig képesek megragadni a P21 napján, az 1 .ábra b) pontja szerint. A vizsgálat során a patkányokat jobbra vagy balra helyezték, és a sík szögét öt másodpercenként 5° – kal növelték annak a lejtésnek a maximális szögének meghatározása érdekében, amelyhez a patkány még mindig tarthatott .
2.6. Step-Down elkerülési teszt
ezt a tesztet a memória megtartásának mérésére hajtották végre . A patkányt óvatosan egy hengeres szigetelőállványra helyezték (4.,5 cm átmérőjű és magas) kondicionáló kamrában, hogy 3 percig alkalmazkodjon a környező környezethez. Amint a patkány leereszkedik a peronon, azonnal villamosítják. Az 5 perces edzésen (P26) a patkányokat arra képezték, hogy ugorjanak vissza a platformra, hogy elkerüljék az elektromos stimulációt. A teszteléseken (24 óra edzés után, azaz P27) rögzítették a késleltetési időt (az idő, amikor a patkányok először lépnek le a platformról) és a hibák számát (A patkányok gyakorisága a platformról).
2.7., Morris Water Maze (MWM) Test
a térbeli tanulás és a memória értékelése érdekében a Morris water maze tesztet 5 napig végezték el a korábban leírtak szerint . A víz labirintus (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Sanghaj, Kína) volt osztva négy negyed, és egy platform (5 cm átmérőjű) került 1 cm-rel a víz felszínén egy negyedben. Az edzéseken (P27–P30) az összes patkányt naponta négyszer, négy egymást követő napon képezték ki, és 60 másodpercen belül meg tudták találni a rejtett platformot., Ha a patkány 60 másodpercen belül nem találta meg a platformot, akkor óvatosan a platformra irányították, majd 30 másodpercig hagyták rajta maradni, mielőtt visszaküldték a ketrecbe. A spatial probe trial (P31) napján a platformot eltávolították, és a patkányokat a medencefal felé néző vízbe engedték ugyanabból a pozícióból, mint az edzéseken. Ezt követően rögzítették a mozgási pályákat és a peron helyét átlépők számát.
2, 8., Dot Blotting
a fenti vizsgálatok befejezése után a patkány kölyköket P31-en feláldozták, agyukat pedig egy QIAamp DNS Mini Kit (QIAGEN, Németország) segítségével boncolták fel a bal időbeli kéreg teljes DNS-ének összegyűjtésére. 2,5 µL genomikus DNS-t (100 ng/µL) észleltek a nylon membránokon, majd 80°C-on 30 percig sütjük a keresztkötésű DNS-t . Miután szobahőmérsékleten 5% zsírmentes tejjel 1 órán át blokkolták, a membránt poliklonális 5 hmC antitesttel inkubáltuk (1 : 1000 hígítás, aktív motívum, Egyesült Államok, Cat. Nem., 39769) 4°C-on egy éjszakán át, majd másnap a torma-peroxidáz (HRP) konjugált másodlagos antitestet használták a vizsgálathoz. A dot blot membránt 0, 02% metilénkék (MB) festették az egyenlő terhelés biztosítása érdekében.
2, 9. Hidroximetilált DNS Immunprecipitáció (hMeDIP) Analízis és nagy áteresztőképességű szekvenálás
genomikus DNS-t vontak ki a patkánykölykök bal időbeli kéregéből (kontroll: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) és szonikálták 200-350 bázispárra (bp). A DNS-fragmenseket végül megjavították, az a-farkú és Illumina adaptereket ligálták., Ezután a DNS-t denaturálták és 5 hmC antitestet (Active Motif, Egyesült Államok, Cat. 39769) 4°C-on egy éjszakán át. Az antitest-DNS komplexeket fehérje a/G gyöngyökkel rögzítették. Az immunprecipitált DNS-t megtisztították, és az Illumina HiSeq3000 rendszeren (Illumina, Egyesült Államok) végzett nagy áteresztőképességű szekvenáláson ment keresztül .
2.10. A szekvenálási adatok és a bioinformatika leképezése
a szekvenálási adatok feldolgozása a korábban leírtak szerint történt . Fastq szekvenciafájlok a biológiai duplikációk után az UCSC patkány referencia genomjához igazodtak (RGSC6.0/rn6) ., A csúcshíváshoz és az annotációhoz egyedi, nem-ismétlődő olvasatokat használtak a motívum gazdagodásának (HOMER) hipergeometrikus optimalizálásával . Az 5-hmC dúsítási csúcsokat a ChIP-Seq (MACS) szoftver modell alapú elemzésével határoztuk meg . A különböző hidroximetilált régiókat (DhMRs) az 5-hmC-vel dúsított minták összes párja között azonosítottuk úgy, hogy minden irányban közvetlenül összehasonlítottuk az egyik mintát a másikkal . Gene ontology (GO) elemzéseket végeztünk a DAVID.
2.11. Kvantitatív RT-PCR
az összes RNS-t kivonták a bal temporális lebeny kéregből., A cDNA fordított átírását a PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japán) segítségével hajtottuk végre. Kvantitatív RT-PCR reakciókat végeztek 7500 valós idejű PCR rendszer (Applied Biosystems, Egyesült Államok) segítségével SYBR green (Takara, Japán). a β-aktint belső kontrollként alkalmazták, a célgén relatív expresszióját pedig a 2-ΔΔCT módszerrel határozták meg., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blot Vizsgálat
Az izolált bal temporális lebeny kéregben volt, ki a jég-hideg fehérje lysate, valamint centrifugált a 12000 r/perc, 20 perc, 4°C-Fehérje minták voltak elválasztva elektroforézis segítségével SDS-PAGE át rá PVDF membrán (Millipore, usa). Miután szobahőmérsékleten 5% zsírmentes tejjel 2 órán át blokkolták, a membránokat az elsődleges antitestekkel inkubáltuk 4°C-on egy éjszakán át, majd HRP-konjugált másodlagos IgG antitestekkel inkubáltuk. Az itt alkalmazott elsődleges antitestek közé tartozik az anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. Nem., 191698), Anti-Tet2 (1 : 1000, Millipore, Egyesült Államok, Cat. # ABE364), Anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, UK, macska. No. 110767), és anti-β tubulin (1 : 2000, Cell Signaling Technology, Egyesült Államok, Cat. #2128). A membránokat ezután ECL detektálással fejlesztették ki, a jeleket Tanon-5200 kemilumineszcens képalkotó rendszerrel (Tanon, Sanghaj, Kína) detektálták. A fehérjeszinteket a Image J software (NIH, Bethesda, USA) elemezte, és a megfelelő β-tubulin szintre normalizálódott.
2.13., Immunfluoreszcencia konfokális mikroszkópia
patkány kölyköket P31-en áldoztak fel, szívüket 0, 9% – os sóoldattal, majd 4% – os paraformaldehiddel (PFA) perfúzálták. A perfúzió után az agyat egy éjszakán át 4% PFA-ban boncolták és rögzítették, majd paraffinba ágyazták és 5 µm-es soros szakaszokká alakították. A mikrohullámú antigén 95°C-on történő citromsavpufferben történő kinyerése után a nem specifikus helyeket 5% szarvasmarha szérum albuminnal (BSA) blokkolták 1 órán keresztül szobahőmérsékleten. Ezután az agyrészeket 5 hmC primer antitesttel inkubálták (1 : 1000, Active Motif, Egyesült Államok, Cat. Nem., 39769) egy éjszakán át 4°C-on követi inkubációs a másodlagos antitesttel (1 : 200, az Élet Technológia, amerikai Egyesült Államok) 1 h a 37°C-4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) használták nukleáris immunofluoreszcens festés, valamint a immunofluoreszcens képek láthatóvá el egy confocal mikroszkóp (Leica sp5, Németország).
2.14. Statisztikai elemzés
az összes adatot az átlag (SEM) átlagos ± standard hibájaként fejeztük ki, és SPSS segítségével elemeztük., A variancia egyirányú elemzését (ANOVA) alkalmazták a 3 csoport közötti különbségek meghatározására, ezt követte a nemparametrikus t-teszt és a Tukey-féle szignifikáns különbségteszt. a <0, 05 értéket statisztikailag szignifikánsnak tekintették.
3. Eredmények
Tuina javította a testsúlycsökkenést, a végtaggyengeséget és a Hi által kiváltott neurológiai reflexek zavarait.,
a patkánykölykök testtömegét P4-ről P28-ra mérték, és megállapították, hogy P22-ről P28-ra a Tuina csoportban (n = 11) a patkányok testtömege jelentősen megnőtt a HI-csoporthoz képest (n = 11; 1.A) ábra). A ferde sík teszt eredményei azt mutatták, hogy a maximális szögek magasabbak voltak a Tuina csoportban, mint a HI csoportban (1.ábra b)), ami a Tuina csoport végtag szilárdságának gyengeségének javulását jelezte., Az idegrendszeri reflexek eredményei a következők voltak: a járási reflexek tesztjében a Hi csoportban lévő patkány kölykök mindkét mellső végtaggal szignifikánsan később elmozdultak a körből, mint a kontroll-és Tuina-csoportok (1.ábra c))). A jobb oldali reflex teszt során a Tuina csoport patkányai rövidebb időt vettek igénybe, hogy jobbra forduljanak, mint a HI csoportban a P7-től a P11-ig (1. ábra d)).
Tuina elősegítette a hipoxiás-ischaemiás patkánykölykök tanulási és memóriafunkcióit.,
Morris water maze test and step-down test were performed to assessment the learning and memory functions of the patkányok. A 2. Ábra(a), a mozgás nyom a szonda tárgyalás napján a MWM teszt azt mutatják, hogy a számos platform helyét kereszteződések a HI csoport szignifikánsan kisebb volt, mint a kontroll csoport pedig Tuina csoport (2. Ábra(b)). A step-down vizsgálatban a HI patkányok szignifikánsan rövidebb késleltetési időt és több hibát mutattak a kontroll-és Tuina patkányokhoz képest(2.C) és 2. D) ábra).
a Tuina 5 hmC és Tet2 szintet emelt a HI patkányok agykéregében.,
annak vizsgálata érdekében, hogy az 5 hmC szintjét befolyásolta-e a CP fejlesztése során, dot blot teszteket végeztünk, és megfigyeltük, hogy a HI patkányok 5 HMC szintje jelentősen csökkent a kontroll szintjéhez képest, míg ez a szint a Tuina után részben emelkedett (; 3.A) ábra). Eközben az immunfluoreszcencia-festés kimutatta az 5 hmC és DAPI-festés összeolvadását, a Hi pedig a bal oldali temporális kéregben a genomikus 5 hmC csökkenéséhez vezetett, míg a Tuina-kezelés visszaállította az 5 hmC szintet bizonyos fokig(3.ábra b))), amely összhangban volt a dot blotting eredményeivel., Továbbá, amint azt a 3.C) és 3. D) ábra mutatja, A HI-csoport a kontrollcsoporthoz képest csökkent Tet1 és Tet2 expressziót mutatott, míg a Tuina-kezelés után csak a Tet2 emelkedett.
3.1. A genomra kiterjedő 5 hmc-változás és-Eloszlás
a genomra kiterjedő 5 hmc pontos helyének és eloszlásának vizsgálata céljából hidroximetilált DNS immunoprecipitációt (HMEDIP), majd következő generációs szekvenálást (hMeDIP-seq) végeztek., A kontroll (n = 3), A HI (n = 3) és a Tuina (n = 3) csoportokból származó patkányokat P31-en áldozták fel, a bal temporális lebenykéreg genomikus DNS-ét pedig hmedip-seq-ra extrahálták. Az 5 hmC szint genomszintű mintáját úgy értékelték, hogy a kontroll, a Tuina és a HI csoportok mintáiból 5 HMC-leképezett leolvasást számoltunk minden 10 kb-os bin-ben, majd normalizáltuk a teljes szekvenálási lefedettséget . Amint az A 4(a)-4(c) ábrán látható, a genomra kiterjedő 5 hmC eloszlása a három csoportban eltérő volt, majd tovább vizsgáltuk azokat a specifikus génrégiókat, amelyekben ezek a különbségek léteznek., A 4.ábra d) pontja az 5 hmC normalizált sűrűség átfedő jellemzőit mutatja a meghatározott géntestek ismert genomikai jellemzőivel, valamint az RGSC6.0/rn6 UCSC-táblázata szerinti CGI-szigetekkel(CPG-szigetek). Továbbá, amint az A 4. ábra e) pontjában látható, megvizsgálták az 5 hmC eloszlását a géntestekben, valamint a géntestek 1 kb – os felfelé és lefelé történő eloszlását is., Megfigyelhető, a Számok 4(d), 4. (e) az 5 hmC szinten a HI csoport eltértek a kontroll csoport pedig Tuina csoport az 5′ végén a genomikus test, különösen a telek ±500 bp a transzkripciós start oldalak (TSS), valamint a CGI belül 500 bp a TSS.
3.2. A differenciális Hidroximetilált régiók (DhMRs)
azonosítása és annotálása a megváltozott 5 hmC-profilt mutató specifikus Loki meghatározása érdekében a genomban minden autoszóma és nemi kromoszóma specifikus Dhmr-jét azonosítottuk és jellemeztük., Érdekes módon nagy különbség volt a hiper-Dhmr-ek és a hipo-Dhmr-ek eloszlásában az X kromoszómán(5(a)-5 (c) ábra). A talált Dhmr-k biológiai jelentőségének további feltárása érdekében az ezekhez a Dhmr-khez kapcsolódó géneket kivonták a gén ontológiai (GO) dúsítási elemzéshez., Mint látható, a Számok 5(d) 5(e), MENJ gazdagodás vizsgálatok azt mutatták, hogy ezek a hypo-DhMRs a HI csoport találtak nagymértékben dúsított, a funkcionális utak kapcsolatos neurodevelopment, valamint idegi funkciók, beleértve a fejlődési sejtek növekedését, neuron vetítés kiterjesztését, a pozitív rendelet a fejlődési, növekedési, fejlődési, növekedési részt morphogenesis, valamint a glia sejt differenciálódás.,
A három csoport hidroximetilációs differenciálgének átfogó elemzése alapján hat hipo-Dhmr-hez kapcsolódó gént választottunk ki a HI csoportból, amelyek mind az idegrendszer funkcióihoz kapcsolódtak, hogy megvizsgáljuk az 5 hmC változások és ezen gének transzkripciós szintje közötti kapcsolatot., Ahogy az várható volt, kiderült, hogy a card1, a Prkg2 és az Slc44a1 csökkentett 5 hmC-módosításának megfelelően a HI-csoportban a megfelelő mRNS-szintek is jelentősen csökkentek a kontroll-és Tuina-csoportokhoz képest (5.ábra f)).
4. Vita
az Általános biztonságosság és a neves hatékonyság, a hagyományos kínai orvoslás (TCM) könnyen elfogadja a lakosság a világ minden tájáról. TCM széles körben alkalmazzák a különböző gyermekgyógyászati betegségek , mint például Ewing-szarkóma , asztma , Graves-betegség, Gyermekgyógyászati allergiás betegségek ., Eközben vannak olyan tanulmányok is, amelyek azt mutatják, hogy a TCM terápiák, köztük a Tuina, a növényi gyógyszerek, valamint az akupunktúra jól toleráltak, és pozitív terápiás hatással vannak az agyi bénulásra . Az ígéretes klinikai eredmények és a kevesebb mellékhatás miatt a kínai Tuina masszázs egyre nagyobb érdeklődést váltott ki a CP kezelésére vonatkozóan.
új epigenetikai módosításként az 5 hmC nemcsak a DNS-demetilációs folyamatok közbenső szerepet játszik, hanem stabil epigenetikus markerként is működik a különböző betegségek kialakulása során ., 5 a hmC körülbelül tízszer nagyobb mértékben dúsított neuronokban, mint más sejtekben, dinamikus szabályozása kritikus a szülés utáni neurodevelopációban . Ezenkívül a globális 5 hmC szint megváltoztatását számos neurodegeneratív rendellenességhez és neurodevelopmentális betegséghez szorosan kapcsolódónak tekintették .
a legjobb tudásunk szerint azonban kevés tanulmány foglalkozott a DNS-hidroximetiláció és az agyi bénulás összefüggésével, ami kutatásaink inspirációjává vált., A tanulmány eredményei dot blot, valamint immunofluoreszcens kiderült, hogy a globális 5 hmC szintű agyi temporális lebeny kéregben jelentősen csökkent, miután SZIA sérülés, ami összhangban van a csökkentett 5 hmC szinten az egér vese után ischaemia-reperfúzió . A Tuina-kezelés után azonban a Tuina-csoportban az 5 hmC szint magasabb volt, mint a HI-csoportban., Továbbá ismert, hogy az 5 hmC-t a Tet fehérjék 5 mC oxidációjával állítják elő, amely alapján a Tet1 és Tet2 fehérjék szintjét detektáltuk, és megállapítottuk, hogy mindkét szint jelentősen csökkent a HI sérülés után, míg a Tuina-kezelés után csak a Tet2 fehérje emelkedett. Összességében ezek a megállapítások azt sugallják, hogy a csökkent Tet1 és Tet2 expresszió hozzájárulhat az 5 hmC csökkenéséhez HI sérülés után, a Tuina pedig a Tet2 expresszió fokozásával növelheti az 5 hmC szintet.,
éppen ellenkezőleg, a promoterek CGI-metilezését kritikusnak találták a gén-elnémításban, és az 5 hmC szerepet játszhat a DNS-demetiláció által közvetített gén expresszióban . Tanulmányunkban a HI-csoport a kontroll-és Tuina-csoportokhoz képest 500 bp-en belül csökkentette a genomra kiterjedő 5 hmC dúsítását a CGI-ben, míg a Tuina növelte az 5 hmC genomra kiterjedő eloszlását., Eközben, összhangban a korábbi megállapítások , hogy a dúsítás 5 hmC a gén test lehet egy erős összefüggés a megnövekedett transzkripció az érintett gének neuronok, mi RT-PCR eredmények azt mutatták, hogy a kimerülése 5 HMC módosítás Prkg2, Casd1, és Slc44a1 gén kísérte a csökkent mRNS szintje ezen gének a HI-csoport., Mindezek alapján a fent említett megállapítások, azt mutatták, hogy 5 hmC módosítás kritikus szerepet játszhat a patogenezisében CP szabályozásával transzkripciós és expressziós gének kapcsolódó neuronális funkciók és Tuina terápiás hatást fejthet ki a CP keresztül moduláló 5 hmC.
még érdekesebb, hogy kiderült, hogy a CP és a kapcsolódó fejlődési rendellenességek gyakrabban fordulnak elő férfi betegeknél, és a HI agyi sérülés nőstény újszülött egérmodellje szintén a CP nemspecifikus alacsonyabb előfordulását mutatta, amelynek oka még mindig bizonytalan., Annak érdekében, hogy elkerüljük az esetleges nemspecifikus védőhatások megzavarását, csak hím patkány kölyköket választottunk ki tanulmányunkhoz. Figyelemre méltó, hogy a genom-wide körkörös térkép megjelenítése (5. Ábra(a)), nagy különbségek megoszlása a hyper-DhMRs, hypo-DhMRs az X kromoszóma volt megfigyelhető az összehasonlítása bármely két csoport a tanulmány, ami tovább erősíti az összefüggést a szex, valamint az esemény bénulás., Nevezetesen, korlátai miatt a laborban, nem tudtunk csinálni IgG ellenőrzési vagy generál a bemeneti könyvtárak, valamint DhMRs azonosítottak által közvetlenül összehasonlítva az egyik, hogy a másik, ahelyett, hogy összehasonlítva a bemeneti, amely azt fogja javítani kívánja a jövőben a vizsgálatok, hogy a kutatás pontosabb.
továbbá a Hi-csoportban a hypo-DhMRs-hez társuló gének GO analízisei azt mutatták, hogy ezek a gének nagymértékben gazdagodnak a neurodevelopációval és neuronális funkciókkal kapcsolatos több jelátviteli úton., Kísérletünkben növekedési retardáció, neurodevelopmentális rendellenességek jelentek meg a HI csoportban fogyás, végtaggyengeség, valamint számos neuronális reflex rendellenesség formájában, amelyeket a Tuina kezelés bizonyos mértékig javított. Ráadásul a Morris water maze teszt és a step-down elkerülési teszt eredményei alapján Tuina jelentősen javította a hipoxiás-ischaemiás patkányok tanulási és memóriafunkcióit., Ezek az eredmények azt mutatják, hogy az összefüggés a változás, 5-hydroxymethylcytosine loci, valamint idegi fejlődés furtherly arra utal, hogy a Tuina kezelés befolyásolhatja az agy fejlesztések, mind a kognitív agyi funkciókat keresztül szabályozza a DNS hydroxymethylation.
a jelen vizsgálatban a genomra kiterjedő 5 hmC kontroll -, HI-és Tuina-csoport térképeket nyújtottunk, és a DNS hidroximetilációs állapotának megváltozását és 5 HMC dinamikus változást tártunk fel a Tuina-kezelés után, amelyek fényt deríthetnek a Tuina CP-re vonatkozó lehetséges terápiás mechanizmusára.,
rendelkezésre álló adatok
a tanulmány megállapításainak alátámasztására használt adatok kérésre a megfelelő szerzőtől érhetők el.
összeférhetetlenség
a szerzők kijelentik, hogy nincs összeférhetetlenség.
A szerzők hozzászólásai
Yunpeng Zhang és Chao Gao egyaránt hozzájárultak ehhez a munkához.,
elismerések
ezt a munkát támogatta a National Natural Science Foundation of China (81774444), Henan Province Science and Technology Research Project (182102310403), China-Canada Cooperative Clinical Research Project, Henan Province Study Abroad Program (201721), and Henan Province Medical Science and Technology Research Project (Provincial and Ministry Construction Project) (201701034).