Abstract
Oltre alle anomalie del motore e della postura, i bambini con paralisi cerebrale (CP) hanno spesso disabilità intellettiva. Come terapia complementare e alternativa della medicina tradizionale cinese (TCM), il massaggio cinese Tuina, chiamato anche Tuina in Cina, è stato ampiamente applicato nel trattamento clinico per CP in Cina per lungo tempo. Tuttavia, la base molecolare per questo rimane ancora in gran parte sconosciuta., Recentemente, l’idrossimetilazione del DNA ha dimostrato di essere sensibile all’ambiente e svolge un ruolo critico in alcuni disturbi neurologici, mentre la ricerca incentrata sulla relazione tra 5 hmC e la terapia Tuina per la paralisi cerebrale è carente. Nel nostro studio, abbiamo osservato per la prima volta che Tuina ha migliorato le funzioni di apprendimento e memoria dei cuccioli di ratto ipossico-ischemico (HI). Nel frattempo, il livello 5 hmC della corteccia del lobo temporale nel modello di ratto neonatale HI è diminuito significativamente rispetto a quello dei ratti nei gruppi di controllo e Tuina., Quindi, abbiamo usato il metodo hMeDIP-Seq per esplorare se e come l’idrossimetilazione del DNA è coinvolta nella terapia Tuina per la paralisi cerebrale. L’annotazione genomica di DhMRs dell’ipo-idrossimetilazione del gruppo HI ai geni ha rivelato l’arricchimento in vie di segnalazione multiple del neurosviluppo. Inoltre, abbiamo scoperto che l’esaurimento di 5 modificazioni hmC nei geni associati allo sviluppo neuronale era accompagnato da livelli ridotti di mRNA di questi geni., Presi insieme, i nostri risultati indicano che Tuina può regolare l’espressione dei geni legati al neurosviluppo modificando lo stato dell’idrossimetilazione del DNA, migliorando così le funzioni di apprendimento e memoria della paralisi cerebrale.
1. Introduzione
La lesione cerebrale che si verifica durante il periodo perinatale è una delle principali cause di disabilità acquisita., L’insorgenza di lesioni cerebrali nei neonati è correlata a molteplici fattori, come l’ipossia-ischemia, l’infezione, lo stress ossidativo e la risposta infiammatoria tra cui l’ipossia-ischemia (HI) può indurre paralisi cerebrale (CP) innescando lesioni cerebrali perinatali nel pretermine . La CP è la disabilità cronica neonatale più comune, caratterizzata da menomazioni motorie e posturali, ed è spesso accompagnata da deficit cognitivi e di apprendimento . Negli studi scientifici di base, il modello di ratto neonatale HI è stato ampiamente utilizzato nell’esplorazione dei risultati comportamentali e della patogenesi della paralisi cerebrale ., Nonostante il grande progresso negli studi CP, i meccanismi molecolari di come l’ipossia-ischemia contribuisce allo sviluppo e alla progressione della CP rimangono ancora poco chiari.
Fino ad oggi, le attuali terapie per CP comprende principalmente chirurgia ortopedica, farmaci antispasticità, e vari tipi di interventi di apprendimento motorio , la maggior parte dei quali si limitano a lavorare per trattare le complicazioni legate alla CP e possono portare effetti collaterali., Tuttavia, la medicina tradizionale cinese (TCM), tra cui Tuina, agopuntura e fitoterapia, da sola o combinata con la terapia convenzionale della medicina occidentale, è stata ampiamente utilizzata come trattamento alternativo per CP in Cina . Tuina è un’antica forma di massaggio medico nella medicina cinese, con la pressione delle dita applicata ai punti terapeutici che sono putativamente sensibilizzati dalla compromissione degli organi . In particolare, Tuina, come intervento più sicuro ed efficace, ha mostrato evidenti effetti sulla paralisi cerebrale nella pratica clinica. Tuttavia, il meccanismo esatto di come funziona Tuina su CP non è stato ancora chiarito.,
Al contrario, patogenicamente, le modificazioni epigenetiche sensibili all’ambiente hanno già dimostrato di essere coinvolte nella neurogenesi , nell’apprendimento e nella memoria e nella plasticità sinaptica . Tra le varie modificazioni epigenetiche, la metilazione del DNA sul quinto carbonio della citosina (5-metilcitosina, 5 mC) è la modificazione epigenetica più ampiamente studiata che svolge ruoli importanti nel rimodellamento della struttura della cromatina, nella soppressione trascrizionale e nella differenziazione cellulare ., Inoltre, l’ossidazione di 5 mC in 5-idrossimetilcitosina (5 hmC) da parte della famiglia genica di traslocazione ten-eleven (TET) è proposta come un nuovo meccanismo per la rimozione di 5 mC e 5 hmC è stato suggerito per essere critico nel mantenimento della struttura e delle funzioni dei neuroni a causa del suo ovvio arricchimento nel cervello . Nel frattempo, l’alterazione di 5 hmC è anche identificata da molti studi per essere associata a disturbi neurologici , come il morbo di Alzheimer , la sindrome di Rett , la sindrome da tremore/atassia associata a X fragile , la malattia di Huntington e i disturbi dello spettro autistico ., Queste evidenze hanno fornito la base per l’ipotesi che le alterazioni di 5 hmC possano svolgere ruoli critici nella malattia del sistema nervoso.,
Per esplorare la presenza di un coinvolgimento di Tuina terapia l’alterazione di 5 hmC in CP, abbiamo applicato una consolidata chimici, etichettatura e metodo di purificazione di affinità accoppiato con high-throughput sequencing technology per rivelare il possibile genome-wide 5 hmC alterazioni HI ratti prima e dopo il trattamento Tuina per cercare il rapporto tra il 5 hmC e Tuina effetti terapeutici su CP e, quindi, di fornire prove a sostegno di applicazione del Tuina terapia per la paralisi cerebrale.
2. Materiali e metodi
2.1., Modello animale
Tutti gli esperimenti sono stati approvati dal Comitato Etico per la cura degli animali dell’ospedale Jinshan affiliato all’Università Fudan. Un modello di riso-Vannucci modificato è stato utilizzato come descritto in precedenza . Il modello neonatale HI è stato eseguito su cuccioli di ratto maschio Sprague-Dawley (Slac Laboratory Animal Company, Shanghai, Cina) il giorno 3 postnatale (P3) tramite legatura dell’arteria carotide comune sinistra sotto anestesia isoflurano 3%. Il tempo di intervento per ciascun ratto è stato controllato entro 10 minuti., Dopo il recupero per 1 ora, questi cuccioli sono stati posti in una camera di ipossia a 37°C e sottoposti al miscelatore di gas composto da 8% O2 e 98% N2 per 3,5 ore. Gli animali finti hanno avuto la stessa operazione per esporre l’arteria carotide comune senza legatura e ipossia. Dopo l’intervento chirurgico, i cuccioli di ratto sono stati restituiti alla loro gabbia di casa.
2.2. Trattamento Tuina
Il trattamento Tuina è stato eseguito da un ricercatore specializzato con certificato medico professionale. Dal giorno di P4 a P31, i cuccioli di ratto nel gruppo Tuina hanno accettato l’intervento di Tuina che viene eseguito 120 volte / min per 15 minuti, una volta al giorno.,f Tuina è come segue: in primo luogo, il ratto è stato messo sul palmo della manipolatore mano sinistra per regolare l’ambiente; in secondo luogo, il manipolatore utilizzato il dito medio della sua mano destra per strofinare delicatamente il ratto dal collo alla coda per tre volte a rilassare i suoi muscoli; in terzo luogo, il Tuina è stata effettuata da successive sfregamento, impastamento, e con un dito spingendo lungo la colonna vertebrale dei ratti dall’alto verso il basso e dall’interno verso l’esterno sul dorso e ambilateral legamenti e dei muscoli lungo la du meridiano meridiano di vescica del ratto con riferimento alle relative medicina tradizionale Cinese (MTC) funziona.,
2.3. Riflesso di raddrizzamento
Il riflesso di raddrizzamento dei ratti neonatali è stato valutato da P5 a P11, come descritto in precedenza . Durante questo test, i cuccioli di ratto sono stati posti in posizione supina su una superficie piana pulita e il tempo per questi cuccioli di raggiungere la posizione prona con tutte e quattro le zampe è stato misurato.
2.4. Riflesso dell’andatura
I cuccioli di ratto sono stati posti al centro di un cartone arrotondato bianco (13 cm di diametro) e il giorno in cui si sono spostati dal cerchio con entrambi gli arti anteriori è stato registrato .
2.5., Test del piano inclinato
Questo test è stato utilizzato per misurare la forza degli arti registrando l’angolo massimo della pendenza su cui i cuccioli di ratto riescono ancora ad aggrapparsi il giorno di P21, come mostrato nella figura 1(b) . Durante questo test, i ratti sono stati posti di fronte a destra oa sinistra e l’angolo del piano è stato aumentato di 5° ogni cinque secondi al fine di determinare l’angolo massimo della pendenza a cui il ratto poteva ancora tenere .
2.6. Step-Down Avoidance Test
Questo test è stato implementato per misurare la conservazione della memoria . Un topo è stato delicatamente posizionato su una piattaforma di isolamento cilindrica (4.,5 cm di diametro e altezza) in una camera di condizionamento per adattarsi all’ambiente circostante per 3 min. Una volta che il ratto scende dalla piattaforma, sarà elettrificato immediatamente. Nella sessione di allenamento di 5 minuti (P26), i ratti sono stati addestrati a tornare sulla piattaforma per evitare la stimolazione elettrica. Nelle sessioni di test (24 h dopo l’allenamento, cioè P27), sono stati registrati il tempo di latenza (il tempo per i ratti di scendere dalla piattaforma per la prima volta) e il numero di errori (frequenza dei ratti che scendono dalla piattaforma).
2.7., Morris Water Maze (MWM) Test
Al fine di valutare l’apprendimento spaziale e la memoria, il test Morris water maze è stato eseguito per 5 giorni come descritto in precedenza . Il labirinto dell’acqua (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, Cina) è stato diviso in quattro quadranti e una piattaforma (5 cm di diametro) è stata posizionata 1 cm sotto la superficie dell’acqua in un quadrante. Nelle sessioni di allenamento (P27–P30), tutti i ratti sono stati addestrati quattro volte al giorno per quattro giorni consecutivi e gli è stato permesso di trovare la piattaforma nascosta entro 60 s., Se il ratto non è riuscito a trovare la piattaforma entro 60 s, è stato delicatamente guidato alla piattaforma e ha permesso di rimanere su di esso per 30 s prima di essere rispedito alla gabbia. Il giorno della prova della sonda spaziale (P31), la piattaforma è stata rimossa e i ratti sono stati rilasciati nell’acqua di fronte al muro della piscina dalla stessa posizione delle sessioni di allenamento. Successivamente, sono state registrate le tracce di movimento e il numero di incroci di posizione della piattaforma.
2.8., Dot Blotting
Dopo il completamento dei test di cui sopra, i cuccioli di ratto sono stati sacrificati su P31 e il loro cervello è stato sezionato per raccogliere il DNA totale della corteccia temporale sinistra da un Mini kit QIAamp DNA (Qiagen, Germania). 2,5 µL di DNA genomico (100 ng/µL) è stato individuato sulle membrane di nylon seguita da cottura a 80°C per 30 min per cross-link DNA . Dopo aver bloccato con latte 5% senza grassi per 1 h a temperatura ambiente, la membrana è stata incubata con anticorpo policlonale 5 hmC (diluizione 1 : 1000, Active Motif, Stati Uniti, Cat. No., 39769) a 4 ° C durante la notte e l’anticorpo secondario coniugato con perossidasi di rafano (HRP) è stato usato per sondare il giorno successivo. La membrana dot blot è stata macchiata con lo 0,02% di blu di metilene (MB) per garantire un carico uguale.
2.9. Analisi di immunoprecipitazione del DNA idrossimetilato (hMeDIP) e sequenziamento ad alto rendimento
Il DNA genomico è stato estratto dalla corteccia temporale sinistra dei cuccioli di ratto (controllo: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) e sonicato a 200-350 coppie di basi (bp). E i frammenti di DNA sono stati riparati; gli adattatori A coda e Illumina sono stati ligati., Quindi, il DNA legante l’adattatore è stato denaturato e incubato con 5 anticorpi hmC (Motivo attivo, Stati Uniti, Cat. No. 39769) a 4°C durante la notte. I complessi anticorpo-DNA sono stati catturati dalle perle proteiche A/G. Il DNA immunoprecipitato è stato purificato e sottoposto a sequenziamento ad alto throughput eseguito sul sistema Illumina HiSeq3000 (Illumina, Stati Uniti) .
2.10. Mappatura dei dati di sequenziamento e bioinformatica
L’elaborazione dei dati di sequenziamento è stata eseguita come descritto in precedenza . I file di sequenza FASTQ dopo le duplicazioni biologiche sono stati allineati al genoma di riferimento UCSC rat (RGSC6 .0 / rn6)., Le letture uniche e non duplicate sono state utilizzate per la chiamata e l’annotazione di picco mediante l’ottimizzazione ipergeometrica dell’arricchimento del motivo (HOMER) . I picchi di arricchimento 5-hmC sono stati determinati utilizzando un’analisi basata su modelli del software ChIP-Seq (MACS). E le regioni differenzialmente idrossimetilate (DhMRs) sono state identificate tra tutte le coppie di campioni arricchiti con 5-hmC confrontando direttamente un campione con un altro in ogni direzione . Le analisi di ontologia genica (GO) sono state eseguite utilizzando il DAVID .
2.11. RT-PCR quantitativa
L’RNA totale è stato estratto dalla corteccia del lobo temporale sinistro., La trascrizione inversa del cDNA è stata eseguita utilizzando il kit PrimeScript RT Master Mix (Takara, Giappone). Le reazioni quantitative RT-PCR sono state eseguite su 7500 real-time PCR system (Applied Biosystems, Stati Uniti) utilizzando SYBR green (Takara, Giappone). la β-actina è stata utilizzata come controllo interno e l’espressione relativa del gene bersaglio è stata determinata dal metodo 2−ΔΔCT., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
La corteccia isolata del lobo temporale sinistro è stata aggiunta con lisato di proteine ghiacciato e centrifugata a 12000 giri/min per 20 min a 4°C. I campioni di proteine sono stati separati mediante elettroforesi utilizzando SDS-PAGE e trasferiti su membrane PVDF (Millipore, Stati Uniti). Dopo il blocco con latte 5% non grasso per 2 h a temperatura ambiente, le membrane sono state incubate con gli anticorpi primari a 4°C durante la notte e quindi incubate con anticorpi IgG secondari coniugati con HRP. Gli anticorpi primari utilizzati qui includevano anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. No., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, Stati Uniti, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1: 1000, Abcam, Regno Unito, Cat. No. 110767), e anti-β tubulina (1: 2000, Cell Signaling Technology, Stati Uniti, Cat. #2128). Le membrane sono state quindi sviluppate utilizzando il rilevamento ECL e i segnali sono stati rilevati con il sistema di imaging chemiluminescente Tanon-5200 (Tanon, Shanghai, Cina). I livelli di proteine sono stati analizzati dal software Image J (NIH, Bethesda, USA) e normalizzati al corrispondente livello di β-tubulina.
2.13., Microscopia confocale di immunofluorescenza
I cuccioli di ratto sono stati sacrificati su P31 e i loro cuori sono stati perfusi con soluzione salina allo 0,9% seguita da paraformaldeide al 4% (PFA). Dopo la perfusione, i cervelli sono stati sezionati e fissati in 4% PFA durante la notte, seguiti da essere incorporati in paraffina e trasformati in sezioni seriali da 5 µm. Dopo il recupero dell’antigene a microonde in tampone di acido citrico a 95°C, i siti non specifici sono stati bloccati con il 5% di albumina sierica bovina (BSA) per 1 ora a temperatura ambiente. Successivamente, le sezioni cerebrali sono state incubate con 5 anticorpi primari hmC (1: 1000, Active Motif, Stati Uniti, Cat. No., 39769) durante la notte a 4°C seguita da incubazione con l’anticorpo secondario (1 : 200, Life Technology, Stati Uniti) 1 h a 37°C. 4′,6-diammino-2-fenilindolo (DAPI) è stato utilizzato per la colorazione di immunofluorescenza nucleare e le immagini di immunofluorescenza sono state visualizzate e catturate su un microscopio confocale (Leica sp5, Germania).
2.14. Analisi statistica
Tutti i dati sono stati espressi come errore medio ± standard della media (SEM) e analizzati utilizzando SPSS., L’analisi unidirezionale della varianza (ANOVA) è stata applicata per determinare le differenze tra i 3 gruppi, seguita da t-test non parametrico e Tukey test di differenza onestamente significativa. valore<0.05 è stato considerato statisticamente significativo.
3. Risultati
Tuina ha migliorato la perdita di peso, la debolezza della forza degli arti e i disturbi dei riflessi neurologici indotti dall’HI.,
Il peso corporeo dei cuccioli di ratto è stato misurato da P4 a P28 e si è riscontrato che, da P22 a P28, il peso corporeo dei ratti nel gruppo Tuina (n = 11) è aumentato significativamente rispetto al gruppo HI (n = 11; Figura 1(a)). I risultati del test del piano inclinato hanno mostrato che gli angoli massimi erano più alti nel gruppo Tuina rispetto a quelli nel gruppo HI (Figura 1(b)), che indicava un miglioramento della debolezza della forza degli arti nel gruppo Tuina., I risultati dei riflessi del sistema nervoso erano i seguenti: nel test dei riflessi dell’andatura, i cuccioli di ratto nel gruppo HI hanno iniziato ad allontanarsi dal cerchio con entrambi gli arti anteriori significativamente più tardi rispetto a quelli nei gruppi di controllo e Tuina (Figura 1(c)). Nel test del riflesso di raddrizzamento, i ratti del gruppo Tuina hanno impiegato più tempo per correggersi rispetto a quelli del gruppo HI da P7 a P11 (Figura 1 (d)).
Tuina ha promosso l’apprendimento e le funzioni di memoria dei cuccioli di ratto ipossico-ischemico.,
Morris water maze test e step-down test sono stati eseguiti per valutare le funzioni di apprendimento e di memoria dei ratti. Come mostrato nella figura 2 (a), le tracce di movimento nel giorno di prova della sonda del test MWM mostrano che il numero di incroci di posizione della piattaforma del gruppo HI era significativamente inferiore a quello del gruppo di controllo e del gruppo Tuina (Figura 2(b)). Nel test step-down, i ratti HI hanno mostrato tempi di latenza significativamente più brevi e più errori rispetto ai ratti control e Tuina(Figure 2(c) e 2 (d)).
Tuina ha aumentato i livelli di 5 hmC e Tet2 nella corteccia temporale cerebrale dei ratti HI.,
Per esaminare se il livello di 5 hmC è stato influenzato durante lo sviluppo CP, abbiamo eseguito test dot blot e osservato che il livello di 5 hmC dei ratti HI è diminuito significativamente rispetto a quello del controllo, mentre questo livello è stato parzialmente aumentato dopo Tuina (; Figura 3(a)). Nel frattempo, immunofluorescenza colorazione dimostrato la fusione di 5 hmC e DAPI colorazione e HI ha portato a diminuire in genomica 5 hmC nella corteccia temporale sinistra, mentre il trattamento Tuina restaurato 5 livello di hmC in una certa misura (Figura 3(b)), che era in coerenza con i risultati di dot blotting., Inoltre, come mostrato nelle figure 3(c) e 3(d), il gruppo HI ha mostrato una diminuzione dell’espressione di Tet1 e Tet2 rispetto al gruppo di controllo, mentre solo Tet2 è stato aumentato dopo la terapia con Tuina.
3.1. Alterazione e distribuzione di 5 hmc a livello genomico
Per studiare la posizione e la distribuzione esatte di 5 hmc a livello genomico, l’immunoprecipitazione idrossimetilata del DNA (hMeDIP) seguita dal sequenziamento di prossima generazione (hMeDIP-seq) è stata effettuata., I ratti, rispettivamente, dai gruppi di controllo (n = 3), HI (n = 3) e Tuina (n = 3) sono stati sacrificati su P31 e il DNA genomico della corteccia del lobo temporale sinistro è stato estratto per hMeDIP-seq. Il modello genome-wide di 5 livelli di hmC è stato valutato contando 5 letture hmC mappate in ogni contenitore da 10 kb dai campioni dei gruppi di controllo, Tuina e HI e quindi normalizzato alla copertura totale del sequenziamento . Come mostrato nelle figure 4 (a) -4 (c), la distribuzione del genoma-wide 5 hmC legge nei tre gruppi era diversa, e poi abbiamo ulteriormente esplorato le regioni specifiche del gene in cui esistono queste differenze., La figura 4 (d) mostra le caratteristiche sovrapposte della densità normalizzata di 5 letture hmC con le caratteristiche genomiche note su corpi genici definiti e CGI (isole CpG) secondo la tabella UCSC per RGSC6.0/rn6. Inoltre, come mostrato nella Figura 4(e), sono state studiate anche le distribuzioni di 5 hmC ai corpi genici e 1 kb a monte e a valle dei corpi genici., Si può osservare dalle figure 4 (d) e 4 (e) che il livello 5 hmC del gruppo HI differiva da quelli del gruppo di controllo e del gruppo Tuina all’estremità 5′ del corpo genomico, specialmente nei siti di ±500 bp dei siti di inizio trascrizionale (TSS) e del CGI entro 500 bp di TSS.
3.2. Identificazione e annotazione di regioni differenzialmente idrossimetilate (DhMRs)
Per individuare i loci specifici che presentano 5 profili hmC alterati, abbiamo proceduto a identificare e caratterizzare i DhMRs specifici di tutti gli autosomi e cromosomi sessuali in tutto il genoma., È interessante notare che c’era una grande differenza nella distribuzione di iper-DhMRs e ipo-DhMRs sul cromosoma X (Figure 5(a)-5(c)). Per esplorare ulteriormente il significato biologico dei DHMR trovati, i geni associati a questi DHMR sono stati estratti per l’analisi di arricchimento dell’ontologia genica (GO)., Come mostrato nelle figure 5(d) e 5(e), l’analisi di arricchimento GO ha indicato che questi ipo-DHMR nel gruppo HI sono stati trovati altamente arricchiti sui percorsi funzionali correlati al neurosviluppo e alle funzioni neuronali, inclusa la crescita delle cellule dello sviluppo, l’estensione della proiezione dei neuroni, la regolazione positiva della crescita dello sviluppo, la crescita dello sviluppo coinvolta nella morfogenesi e la differenziazione delle cellule gliali.,
Sulla base dell’analisi completa degli elenchi di geni differenziali di idrossimetilazione dei tre gruppi, abbiamo selezionato sei geni associati a ipo-DhMRs dal gruppo HI che erano tutti associati alle funzioni del sistema nervoso per indagare la relazione tra 5 alterazioni hmC e livelli di trascrizione di questi geni., Come previsto, è stato scoperto che, in conformità con la modifica ridotta di 5 hmC in Casd1, Prkg2 e Slc44a1, anche i corrispondenti livelli di mRNA erano significativamente diminuiti nel gruppo HI rispetto a quelli nei gruppi control e Tuina (Figura 5(f)).
4. Discussione
Con la sicurezza generale e l’efficacia reputata, la medicina tradizionale cinese (TCM) è prontamente accettata dalla popolazione generale in tutto il mondo. La TCM è stata ampiamente applicata in varie malattie pediatriche , come il sarcoma di Ewing , l’asma , la malattia di Graves e i disturbi allergici pediatrici ., Nel frattempo, ci sono anche studi che indicano che le terapie TCM tra cui Tuina, medicinali a base di erbe e agopuntura sono ben tollerate e hanno effetti terapeutici positivi sulla paralisi cerebrale . A causa dei risultati clinici promettenti e meno effetti collaterali, il massaggio cinese Tuina ha attirato un crescente interesse in termini di trattamento per CP.
Come nuova modificazione epigenetica, 5 hmC non solo funge da intermedio dei processi di demetilazione del DNA, ma funge anche da marcatore epigenetico stabile durante lo sviluppo di varie malattie ., 5 hmC è circa dieci volte più arricchito nei neuroni che in altre cellule e la sua regolazione dinamica è fondamentale nel neurosviluppo postnatale . Inoltre, l’alterazione del livello globale di hmC 5 è stata considerata strettamente correlata a molte malattie neurodegenerative e malattie dello sviluppo neurologico .
Tuttavia, al meglio delle nostre conoscenze, pochi studi sono stati focalizzati sulla connessione tra idrossimetilazione del DNA e paralisi cerebrale, che è diventata l’ispirazione per la nostra ricerca., Nel nostro studio, i risultati di dot blotting e immunofluorescenza hanno rivelato che il livello globale di 5 hmC nella corteccia del lobo temporale cerebrale era significativamente diminuito dopo la lesione HI, che è coerente con il ridotto livello di 5 hmC nel rene del topo dopo ischemia-riperfusione . Tuttavia, dopo il trattamento con Tuina, il livello di hmC 5 nel gruppo Tuina era superiore a quello nel gruppo HI., Inoltre, è noto che 5 hmC è prodotto tramite l’ossidazione di 5 mC dalle proteine Tet, in base alle quali abbiamo rilevato i livelli di proteine Tet1 e Tet2 e abbiamo scoperto che entrambi i livelli erano significativamente diminuiti dopo la lesione HI, mentre solo la proteina Tet2 era aumentata dopo il trattamento con Tuina. In tutto, questi risultati implicano che la ridotta espressione di Tet1 e Tet2 può contribuire alla diminuzione di 5 hmC dopo la lesione HI e Tuina può aumentare il livello di 5 hmC migliorando l’espressione di Tet2.,
Al contrario, la metilazione CGI nei promotori è stata trovata critica nel silenziamento genico e 5 hmC può svolgere un ruolo nell’espressione genica mediata dalla demetilazione del DNA . Nel nostro studio, il gruppo HI ha mostrato una diminuzione dell’arricchimento di 5 hmC a livello del genoma in CGI entro 500 bp di TSS rispetto ai gruppi di controllo e Tuina, mentre Tuina ha aumentato la distribuzione a livello del genoma di 5 hmC., Nel frattempo , in linea con le precedenti scoperte che l’arricchimento di 5 hmC nel corpo del gene può avere una forte correlazione con l’aumento della trascrizione dei geni interessati nei neuroni, i nostri risultati RT-PCR hanno mostrato che l’esaurimento della modifica di 5 hmC nel gene Prkg2, Casd1 e Slc44a1 era accompagnato dai ridotti livelli di mRNA di questi geni nel gruppo HI., Sulla base di tutti questi risultati sopra menzionati, è stato indicato che la modifica di 5 hmC può svolgere un ruolo critico nella patogenesi della CP attraverso la regolazione della trascrizione e dell’espressione dei geni relativi alle funzioni neuronali e Tuina può produrre effetti terapeutici sulla CP tramite la modulazione di 5 hmC.
Più interessante, è stato riscontrato che CP e disturbi dello sviluppo correlati sono più comuni nei pazienti maschi e il modello di topo neonatale femminile di lesione cerebrale HI ha anche mostrato una minore incidenza di CP specifica per genere , la cui ragione è ancora incerta., Al fine di evitare l’interruzione di questi possibili effetti protettivi specifici per genere, solo i cuccioli di ratto maschi sono stati selezionati per il nostro studio. Sorprendentemente, in genome-wide circular map(Figura 5 (a)), grandi differenze nella distribuzione di iper-DhMRs e ipo-DhMRs sul cromosoma X sono state osservate dal confronto tra due gruppi qualsiasi nel nostro studio, che conferma ulteriormente la correlazione tra il sesso e l’insorgenza di paralisi cerebrale., In particolare, a causa delle limitazioni del nostro laboratorio, non abbiamo potuto controllare le IgG o generare le librerie di input, e i DHMR sono stati identificati confrontando direttamente l’uno con l’altro piuttosto che confrontando l’input, che intendiamo migliorare nei nostri studi futuri per rendere la ricerca più precisa.
Inoltre, le analisi GO di geni associati a ipo-DhMRs nel gruppo HI hanno dimostrato che questi geni sono altamente arricchiti in molteplici vie di segnalazione correlate allo sviluppo neurologico e alle funzioni neuronali., Nel nostro esperimento, ritardo della crescita e disturbi dello sviluppo neurologico sono apparsi nel gruppo HI sotto forma di perdita di peso, debolezza nella forza degli arti e diversi disturbi riflessi neuronali che sono stati migliorati dal trattamento Tuina in una certa misura. Inoltre, dai risultati del test Morris water maze e del test di evitamento step-down, Tuina ha migliorato significativamente le funzioni di apprendimento e memoria dei ratti ipossico-ischemici., Questi risultati indicano la correlazione tra l’alterazione del loci 5-idrossimetilcitosina e lo sviluppo neuronale e suggerisce ulteriormente che la terapia Tuina può influenzare gli sviluppi cerebrali e le funzioni cognitive cerebrali tramite la modulazione dell’idrossimetilazione del DNA.
Nel presente studio, abbiamo fornito mappe 5 hmC a livello genomico dei gruppi di controllo, HI e Tuina e abbiamo rivelato l’alterazione dello stato di idrossimetilazione del DNA e il cambiamento dinamico 5 hmC dopo il trattamento con Tuina, che può far luce sul possibile meccanismo terapeutico di Tuina per CP.,
Disponibilità dei dati
I dati utilizzati per supportare i risultati di questo studio sono disponibili presso l’autore corrispondente su richiesta.
Conflitti di interesse
Gli autori dichiarano che non vi sono conflitti di interesse.
Contributi degli autori
Yunpeng Zhang e Chao Gao hanno contribuito ugualmente a questo lavoro.,
Riconoscimenti
Questo lavoro è stato sostenuto dalla National Natural Science Foundation of China (81774444), dalla provincia di Henan Science and Technology Research Project (182102310403), China-Canada Cooperative Clinical Research Project, Henan Province Study Abroad Program (201721) e dalla provincia di Henan Medical Science and Technology Research Project (Provincial and Ministry Construction Project) (201701034).