Het is belangrijk om bacteriesoorten te kunnen onderscheiden, van het diagnosticeren van infecties of het controleren van de voedselveiligheid, tot het identificeren van welke soorten een kaas het fantastische karakter geeft. De bacteriële species, en zelfs de specifieke spanningen kunnen worden onderscheiden gebruikend een aantal moleculaire technieken zoals PCR, kwantitatieve PCR, genoom het rangschikken en massaspectrometrie., Maar zelfs zonder in de moleculaire nitty gruis te komen, zijn er fenotypische verschillen tussen groepen bacteriën die kunnen worden gebruikt om ze te differentiëren. Dit omvat kenmerken zoals hun vorm (bacillen vs cocci bijvoorbeeld), groei in het bijzonder voedingsstoffen en voorkeur voor hoge of lage zuurstof omgevingen. Afhankelijk van het kenmerk dat wordt bestudeerd, kunnen bacteriesoorten worden onderverdeeld in brede groepen, maar samen genomen kan deze informatie de mogelijke identiteiten sterk beperken., Een dergelijke nuttige classificatie-als een bacterie Gram positief of Gram negatief is-is gebaseerd op de structuur van bacteriële celwanden.
verschil in structuur van grampositieve Versus gramnegatieve bacteriën
het onderstaande diagram illustreert de verschillen in structuur van grampositieve en gramnegatieve bacteriën. De twee belangrijkste eigenschappen die tot de verschillende visualisatieeigenschappen van grampositieve en gramnegatieve species leiden zijn de dikte van de peptidoglycaanlaag en de aanwezigheid of afwezigheid van het buitenlipidemembraan., Dit is omdat de muurstructuur de capaciteit van de cel beà nvloedt om de kristal violette vlek te behouden die in de Gramkleurende procedure wordt gebruikt die dan onder een lichte microscoop kan worden gevisualiseerd.
Grampositieve bacteriën hebben een dikke peptidoglycaanlaag en geen buitenlipidemembraan, terwijl Grampositieve bacteriën een dunne peptidoglycaanlaag en een buitenlipidemembraan hebben.
aangezien Grampositieve bacteriën geen buitenlipidemembraan hebben, worden ze monodermen genoemd wanneer ze correct verwijzen naar hun structuur in plaats van kleuringeigenschappen., Het buitenlipidemembraan dat door gramnegatieve bacteriën wordt bezeten betekent dat, wanneer zij naar hun fysieke structuur verwijzen, zij diderms worden genoemd.de Gramkleuringstechniek werd in 1884 ontwikkeld door de Deense bacterioloog Hans Christian Gram1. Hoewel een Gramkleur je niet zal vertellen naar welke specifieke soorten je kijkt, kan het een snelle manier zijn om de lijst met potentiële kandidaten sterk te beperken en waar nodig direct vervolgtests uit te voeren.,
Gram-positieve vs Gram-negatieve vlek
Gramkleurprocedure-voorbereiding van een monster
1. Label een schone glazen microscoop dia met uw monster identificatie. Zorg ervoor dat u gebruik maken van een potlood zoveel inkt worden verwijderd door de reagentia gebruikt in de kleuring procedure.
2. Als u de dia bereid uit een vloeibare bacteriecultuur: dep een kleine druppelcultuur op de dia met behulp van een steriele lus. Smeer de druppel voorzichtig in een cirkelvormige beweging in op een gebied met een diameter van ongeveer 1 cm., Voor zeer dichte culturen kan het nodig zijn om vooraf te verdunnen uw cultuur om ervoor te zorgen individuele bacteriële cellen kunnen worden gezien onder een microscoop na het bevlekken.
als het uitgangsmateriaal afkomstig is van een bacteriële plaat:
Resuspendeer een lus koloniemateriaal in steriele fosfaatgebufferde zoutoplossing (PBS) en ga vervolgens verder zoals voor een vloeibare cultuur.
3. Zodra het uitstrijkje lucht gedroogd, passeren de uitgesmeerde schuif door een vlam twee of drie keer.
dit doodt de microben in het uitstrijkje en fixeert het monster aan de dia, wees voorzichtig om het monster echter niet oververhit te raken omdat dit de cellulaire morfologie kan verstoren.,
Gramkleurprocedure-gramkleuring van een monster
1. Laat het uitstrijkje voorzichtig overstromen met kristalviolet en laat het 1 minuut inwerken. Kantel de glijbaan lichtjes en spoel voorzichtig met kraanwater of gedestilleerd water.Crystal violet is een in water oplosbare kleurstof die de peptidoglycaanlaag in de bacteriële celwand binnendringt.
2. Spoel het uitstrijkje voorzichtig met Gram jodium en laat het 1 minuut inwerken. Kantel de glijbaan lichtjes en spoel voorzichtig met kraanwater of gedestilleerd water. Het uitstrijkje zal nu paars lijken.,de jodiumoplossing van Gram (jodium en kaliumjodide) wordt toegevoegd om een complex te vormen met het kristalviolet, dat veel groter is en onoplosbaar is in water.
3. Ontkleuren het uitstrijkje met 95% ethylalcohol of aceton. Kantel de dia lichtjes en breng de alcohol druppel voor druppel aan tot de alcohol bijna helder is (5-10 seconden). Onmiddellijk afspoelen met water om over-ontkleuren te voorkomen.Decolorizer dehydrateert de peptidoglycaanlaag, krimpt en strakker., In Grampositieve bacteriën, zijn de grote kristalviolet-jodiumcomplexen dan niet in staat om de dikke peptidoglycaanlaag te penetreren en te ontsnappen, resulterend in purpere bevlekte cellen. Nochtans, in gramnegatieve bacteriën, wordt het buitenmembraan gedegradeerd, is de dunne peptidoglycanlaag niet in staat om de kristalviolet-jodiumcomplexen te behouden en de kleur wordt verloren.
4. Licht overspoelen met safranin counterstain en 45 seconden laten staan. Kantel de glijbaan lichtjes en spoel voorzichtig met kraanwater of gedestilleerd water.,
Safranine is zwak oplosbaar in water en zal bacteriële cellen een lichtrode kleur geven, waardoor gramnegatieve cellen kunnen worden gevisualiseerd zonder de waarneming van het paarse van de grampositieve cellen te belemmeren.
5. Dep de dia droog op filterpapier en bekijk het uitstrijkje met een lichtmicroscoop onder Olie-onderdompeling.
grampositieve vs gramnegatieve kleur
Grampositieve bacteriën
Grampositieve bacteriën hebben een kenmerkend paars uiterlijk wanneer ze onder een lichtmicroscoop worden waargenomen na gramkleuring., Dit is toe te schrijven aan behoud van de Purpere kristalviolet vlek in de dikke peptidoglycaanlaag van de celwand. Voorbeelden van grampositieve bacteriën zijn alle stafylokokken, alle streptokokken en sommige Listeria-soorten.
gramnegatieve bacteriën
gramnegatieve bacteriën vertonen een bleke roodachtige kleur wanneer ze onder een lichte microscoop worden waargenomen na gramkleuring. Dit komt omdat de structuur van hun celwand is niet in staat om de kristal violet vlek te behouden, zodat alleen gekleurd door de safranine counterstain., De voorbeelden van gramnegatieve bacteriën omvatten enterococcen, salmonella species en pseudomonas species.
gramkleuring kan niet betrouwbaar worden gebruikt om bacteriële fylogenetische relaties te beoordelen. Het enige membraan van grampositieve species wordt verondersteld om de voorouderlijke staat te zijn. Historisch gezien werd gedacht dat het tweede membraan gevonden op gramnegatieve bacteriën slechts één keer evolueerde en dus waren alle gramnegatieve soorten nauwer verwant aan elkaar dan aan grampositieve soorten., Echter, genetische analyse heeft sindsdien aangetoond dat dit niet het geval is en het is waarschijnlijk meerdere keren geëvolueerd in verschillende geslachten – een product van convergente evolutie.