Abstract
naast afwijkingen in motoriek en houding hebben kinderen met cerebrale parese (CP) vaak een verstandelijke beperking. Als complementaire en alternatieve traditionele Chinese geneeskunde (TCM) therapie, Chinese Tuina massage, ook wel Tuina genoemd in China, is op grote schaal toegepast in de klinische behandeling van CP in China voor een lange tijd. De moleculaire basis hiervoor is echter nog grotendeels onbekend., Onlangs is aangetoond dat DNA-hydroxymethylatie gevoelig is voor milieu en een cruciale rol speelt bij sommige neurologische aandoeningen, terwijl het onderzoek dat zich richt op de relatie tussen 5 hmC en Tuina therapie voor cerebrale parese gebrekkig is. In onze studie merkten we voor het eerst op dat Tuina de leer-en geheugenfuncties van hypoxisch-ischemisch (HI) rattenpups verbeterde. Ondertussen, 5 hmC niveau van de temporale kwab cortex in de HI neonatale rat model is significant verminderd in vergelijking met die van de ratten in controle en Tuina groepen., Vervolgens gebruikten we de hmedip-Seq methode om te onderzoeken of en hoe DNA hydroxymethylation betrokken is bij Tuina therapie voor cerebrale parese. Genomic annotatie van DhMRs van hypo-hydroxymethylation van de HI-groep aan genen openbaarde verrijking in veelvoudige neurodevelopmental signalerende wegen. Bovendien vonden wij de uitputting van 5 HMC wijzigingen in genen verbonden aan neuronale ontwikkeling vergezeld ging van verminderde mRNA niveaus van deze genen., Samen geven onze resultaten aan dat Tuina de expressie van neurodevelopment-gerelateerde genen kan reguleren door de status van DNA-hydroxymethylering te veranderen, waardoor het leren en geheugenfuncties van hersenverlamming worden verbeterd.
1. Inleiding
hersenletsel dat optreedt tijdens de perinatale periode is een belangrijke oorzaak voor verworven invaliditeit., Het voorkomen van hersenletsel bij zuigelingen is gecorreleerd met meerdere factoren, zoals hypoxie-ischemie, infectie, oxidatieve stress, en ontstekingsreactie waaronder hypoxie-ischemie (HI) cerebrale parese (CP) kan induceren door perinatale cerebrale laesies in premature . CP is de meest voorkomende neonatale chronische handicap, gekenmerkt door motorische en houdingsstoornissen, en gaat vaak gepaard met cognitieve en leerstoornissen . In fundamentele wetenschappelijke studies, is het HI neonatal rat model op grote schaal gebruikt in het verkennen van de gedragsuitkomsten en pathogenese van cerebrale parese ., Ondanks de grote vooruitgang in CP studies, blijven de moleculaire mechanismen van hoe hypoxie-ischemie bijdraagt aan CP ontwikkeling en progressie nog steeds onduidelijk.
tot op de dag van vandaag omvatten de huidige behandelingen voor CP voornamelijk orthopedische chirurgie, antispasticiteitsmedicaties en verschillende soorten motorische leerinterventies, waarvan de meeste alleen werken om de complicaties met betrekking tot CP te behandelen en bijwerkingen kunnen veroorzaken., Nochtans, is de traditionele Chinese geneeskunde (TCM), met inbegrip van Tuina, acupunctuur, en kruidengeneeskunde, alleen of gecombineerd met conventionele therapie van westerse geneeskunde, wijd gebruikt als alternatieve behandeling voor CP in China . Tuina is een oude vorm van medische massage in de Chinese geneeskunde, met toegepaste vingerdruk op acupoints die vermoedelijk worden gesensibiliseerd door orgaanbeschadiging . Met name Tuina, als een veiligere en effectievere interventie, heeft duidelijke effecten op cerebrale parese in de klinische praktijk. Echter, het exacte mechanisme van hoe Tuina werkt op CP is nog niet opgehelderd.,
integendeel, pathogeen, milieugevoelige epigenetische modificaties zijn reeds bewezen betrokken te zijn bij neurogenese , leren en geheugen , en synaptische plasticiteit . Onder diverse epigenetische wijzigingen, is methylation van DNA op de vijfde koolstof van cytosine (5-methylcytosine, 5 mC) de uitgebreidste bestudeerde epigenetische wijziging die belangrijke rollen in chromatin structuur het opnieuw vormen, transcriptional afschaffing, en cellulaire differentiatie speelt ., Verder wordt de oxidatie van 5 mC in 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) door de tien-elf translocatie (Tet) genfamilie voorgesteld als een nieuw mechanisme voor verwijdering van 5 mC , en 5 hmC is voorgesteld om kritisch te zijn in onderhoud van neuronstructuur en functies toe te schrijven aan zijn duidelijke verrijking in de hersenen . Ondertussen, 5 wordt de wijziging HMC ook geà dentificeerd door vele studies om met neurologische wanorde, zoals de ziekte van Alzheimer , het syndroom van Rett , breekbaar x-geassocieerd tremor/ataxie syndroom , de ziekte van Huntington , en de wanorde van het autismespectrum worden geassocieerd ., Deze bewijzen verstrekten de basis voor de hypothese dat 5 HMC veranderingen kritieke rollen in zenuwstelselziekte kunnen spelen.,
om de aanwezigheid van de betrokkenheid van Tuina therapie bij de verandering van 5 hmC in CP te onderzoeken, hebben we een gevestigde chemische labeling en affiniteit zuivering methode toegepast in combinatie met high-throughput sequencing technologie om de mogelijke genoombrede 5 HMC veranderingen bij HI ratten te onthullen voorafgaand aan en na Tuina behandeling om de relatie tussen 5 hmC en Tuina therapeutische effecten op CP te zoeken, waardoor bewijs wordt geleverd ter ondersteuning van de toepassing van Tuina therapie voor cerebrale parese.
2. Materialen en methoden
2.1., Diermodel
alle experimenten werden goedgekeurd door de ethische commissie voor dierenverzorging van het Jinshan ziekenhuis, verbonden aan de Fudan Universiteit. Een gemodificeerd rijst-Vannucci model werd gebruikt zoals eerder beschreven . Het neonatale HI-model werd uitgevoerd op Sprague-Dawley mannelijke ratten pups (Slac Laboratory Animal Company, Shanghai, China) op postnatale dag 3 (P3) via ligatie van de linker gemeenschappelijke halsslagader onder 3% isofluraan anesthesie. De operatietijd voor elke rat werd binnen 10 minuten onder controle gehouden., Na 1 uur herstel werden deze jongen in een hypoxiekamer bij 37°C geplaatst en gedurende 3,5 uur onderworpen aan de gasmenger bestaande uit 8% O2 en 98% N2. Schijndieren hadden dezelfde operatie om de gemeenschappelijke halsslagader bloot zonder ligatie en hypoxie. Na de operatie werden de rattenpups teruggebracht naar hun thuiskooi.
2.2. Tuina behandeling
Tuina behandeling werd uitgevoerd door een gespecialiseerde onderzoeker met een beroepsarts certificaat. Van de dag van P4 tot P31 aanvaardden rattenjongen in de Tuina-groep een Tuina-interventie die 120 keer/min gedurende 15 minuten, eenmaal per dag, wordt uitgevoerd.,f Tuina is als volgt: ten eerste, de rat werd geplaatst op de palm van de manipulator de linkerhand aan te passen aan de omgeving; ten tweede, de manipulator gebruikt de middelvinger van zijn rechterhand wrijf de rat van de nek tot de staart drie keer om te ontspannen de spieren; ten derde, Tuina werd uitgevoerd door de opeenvolgende wrijven, kneden, en met één vinger te duwen langs de ruggengraat van de ratten van boven naar beneden en van binnen naar buiten op de rug, en ambilateral pezen, alsmede de spieren langs de du meridiaan en blaas meridiaan van de rat met een verwijzing naar de desbetreffende traditionele Chinese geneeskunde (TCM) werkt.,
2.3. De oprichtingsreflex
bij neonatale ratten werd beoordeeld van P5 tot P11, zoals eerder beschreven . Tijdens deze test werden de rattenjongen op een gereinigde vlakke ondergrond in rugligging geplaatst en werd de tijd voor deze jongen gemeten om met alle vier de poten de buikpositie te bereiken.
2.4. Loopreflex
rattenjongen werden in het midden van een wit afgerond karton (13 cm in diameter) geplaatst en de dag waarop zij met beide voorpoten van de cirkel afgingen werd geregistreerd .
2.5., Test met hellend vlak
deze test werd gebruikt om de sterkte van de ledematen te meten door de maximale hoek van de helling vast te leggen waarop de rattenjongen op de dag van P21 nog kunnen vasthouden, zoals weergegeven in Figuur 1(b) . Tijdens deze test werden de ratten naar rechts of naar links gericht geplaatst en werd de hoek van het vlak elke vijf seconden met 5° verhoogd om de maximale hoek van de helling te bepalen waaraan de rat nog kon vasthouden .
2.6. Step-Down Vermijdingstest
Deze test werd uitgevoerd om de retentie van het geheugen te meten . Een rat werd voorzichtig op een cilindrisch isolatieplatform geplaatst (4.,5 cm in diameter en hoogte) in een conditioneringskamer aan te passen aan de omgeving gedurende 3 min. Zodra de rat het platform verlaat, zal het onmiddellijk geëlektrificeerd worden. In de 5 minuten durende trainingssessie (P26) werden de ratten getraind om terug op het platform te springen om de elektrische stimulatie te vermijden. In de testsessies (24 uur na de training, d.w.z. P27) werden de latentietijd (de tijd voor de ratten om voor het eerst van het platform af te stappen) en het aantal fouten (frequentie van de ratten die van het platform afstappen) geregistreerd.
2.7., Morris Water Maze (MWM) Test
om ruimtelijk leren en geheugen te evalueren, werd de Morris water maze test gedurende 5 dagen uitgevoerd zoals eerder beschreven . Het water doolhof (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, China) was verdeeld in vier kwadranten, en een platform (5 cm in diameter) werd geplaatst 1 cm onder het wateroppervlak in een kwadrant. In de trainingssessies (P27-P30) werden alle ratten vier keer per dag getraind gedurende vier opeenvolgende dagen, en ze mochten het verborgen platform binnen 60 s vinden., Als de rat er niet in slaagde om het platform binnen 60 s te vinden, werd het voorzichtig naar het platform geleid en toegestaan om er 30 s op te blijven voordat het terug naar de kooi werd gestuurd. Op de dag van de spatial probe trial (P31) werd het platform verwijderd en werden de ratten vanuit dezelfde positie als tijdens de trainingssessies in het water met de zwembadwand geplaatst. Vervolgens werden de bewegingstracks en het aantal perronlocatieovergangen geregistreerd.
2.8., Dot Blotting
na afloop van de bovengenoemde tests werden de rattenjongen geofferd op P31 en werden hun hersenen ontleed voor het verzamelen van het totale DNA van de linker temporale cortex door een QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Duitsland). 2.5 µL genomic DNA (100 ng / µL) werd gespot op nylon membranen gevolgd door bakken bij 80°C gedurende 30 min aan cross-link DNA . Na blokkering met 5% vetvrije melk gedurende 1 uur bij kamertemperatuur, werd het membraan geïncubeerd met polyclonal 5 HMC antilichaam (1 : 1000 verdunning, Active Motif, Verenigde Staten, Cat. Geen., 39769) bij 4°C ‘ s nachts en de mierikswortelperoxidase (HRP)-geconjugeerd secundair antilichaam werd gebruikt om de volgende dag te onderzoeken. Het dot blot membraan werd gekleurd met 0,02% methyleenblauw (MB) om gelijke belasting te garanderen.
2.9. Hydroxymethyleerde DNA Immunoprecipitatieanalyse (hmedip) en high-Throughput Sequencing
genomisch DNA werd geëxtraheerd uit de linker temporale cortex van rattenjongen (controle: n = 3; HI: N = 3; Tuina: n = 3) en gesoniceerd tot 200-350 basenparen (bp). En de DNA-fragmenten werden gerepareerd; a-tailed en Illumina adapters werden gelig gemaakt., Vervolgens werd adapter-ligated DNA gedenatureerd en geïncubeerd met 5 HMC antilichaam (Active Motif, Verenigde Staten, Cat. 39769) bij 4°C ‘ s nachts. Antilichaam-DNA complexen werden gevangen door eiwit A / G parels. Immunoprecipitated DNA werd gezuiverd en onderging high-throughput die rangschikken op het systeem Illumina HiSeq3000 (Illumina, Verenigde Staten) wordt uitgevoerd .
2.10. Mapping van Sequentiegegevens en Bioinformatica
verwerking van sequentiegegevens werd uitgevoerd zoals eerder beschreven . FASTQ sequentie bestanden na biologische duplicaties werden afgestemd op UCSC rat referentie genoom (RGSC6. 0 / rn6)., Unieke, nonduplicate reads werden gebruikt voor peak calling en annotatie door hypergeometrische optimalisatie van motif enrichment (Homerus) . 5-HMC verrijkingspieken werden bepaald gebruikend een model-gebaseerde analyse van spaander-Seq (MACS) software . En differentieel hydroxymethylated gebieden (DhMRs) werden geà dentificeerd onder alle paren van 5-HMC-verrijkte monsters door direct vergelijken van een monster met een ander in elke richting . Gene ontologie (GO) analyses werden uitgevoerd met behulp van de DAVID .
2.11. Kwantitatieve RT-PCR
totaal RNA werd geëxtraheerd uit de linker temporale kwabschors., Reverse transcriptie van cDNA werd uitgevoerd met behulp van de PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japan). Kwantitatieve RT-PCR reacties werden uitgevoerd op 7500 real-time PCR systeem (Applied Biosystems, Verenigde Staten) met SYBR green (Takara, Japan). β-actin werd gebruikt als interne controle, en de relatieve uitdrukking van doelgen werd bepaald door de 2−ΔΔCT methode., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
De geïsoleerde linker temporale kwab cortex werd toegevoegd met ijskoude eiwit lysaat en gecentrifugeerd bij 12000 r/min gedurende 20 min bij 4°C. Eiwitmonsters werden gescheiden door elektroforese met behulp van SDS-PAGE en overgebracht op PVDF-membranen (Millipore, Verenigde Staten). Na blokkering met 5% vetvrije melk gedurende 2 uur bij kamertemperatuur, werden de membranen ‘ s nachts geïncubeerd met de primaire antilichamen bij 4°C en vervolgens geïncubeerd met HRP-geconjugeerde secundaire IgG-antilichamen. De primaire antilichamen die hier werden gebruikt, waren anti-Tet1 (1: 1000, Abcam, UK, Cat. Geen., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, Verenigde Staten, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1: 1000, Abcam, UK, Cat. Nr. 110767), en anti-β tubuline (1: 2000, Cell Signaling Technology, Verenigde Staten, Cat. #2128). De membranen werden vervolgens ontwikkeld met behulp van ECL-detectie, en de signalen werden gedetecteerd met Tanon-5200 Chemiluminescent Imaging System (Tanon, Shanghai, China). De eiwitniveaus werden geanalyseerd met Image J software (NIH, Bethesda, USA) en genormaliseerd tot het overeenkomstige β-tubuline niveau.
2.13., Immunofluorescentie confocale microscopie
rattenjongen werden geofferd op P31 en hun hart werd geperfundeerd met 0,9% zoutoplossing gevolgd door 4% paraformaldehyde (PFA). Na perfusie werden de hersenen ontleed en in 4% PFA ‘ s nachts gefixeerd, gevolgd door ingebed in paraffine en tot 5 µm seriële secties gemaakt. Na het ophalen van microgolfantigeen in citroenzuurbuffer bij 95°C werden niet-specifieke locaties Geblokkeerd met 5% bovine serum albumine (BSA) gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Vervolgens werden de hersensecties geïncubeerd met 5 HMC primaire antilichamen (1: 1000, Active Motif, Verenigde Staten, Cat. Geen., 39769)’s nachts bij 4°C gevolgd door incubatie met het secundaire antilichaam (1 : 200, Life Technology, Verenigde Staten) 1 uur bij 37°C. 4′, 6-diamino-2-phenylindol (DAPI) werd gebruikt voor het kleuren van nucleaire immunofluorescentie, en de immunofluorescentiebeelden werden gevisualiseerd en vastgelegd op een confocale microscoop (Leica sp5, Duitsland).
2.14. Statistische analyse
alle gegevens werden uitgedrukt als de gemiddelde ± standaardfout van het gemiddelde (SEM) en geanalyseerd met behulp van SPSS., Eenrichtingsanalyse van variantie (ANOVA) werd toegepast om de verschillen tussen de 3 groepen te bepalen, gevolgd door niet-parametrische t-test en Tukey eerlijk significante verschiltest. waarde <0,05 werd statistisch significant geacht.
3. Resultaten
Tuina verbeterde gewichtsverlies, zwakte van de ledematen en stoornissen van neurologische reflexen veroorzaakt door HI.,
lichaamsgewicht van rattenpups werd gemeten van P4 tot P28, en er werd vastgesteld dat, van P22 tot P28, het lichaamsgewicht van de ratten in de Tuina-groep (n = 11) significant toenam in vergelijking met de HI-Groep (N = 11; figuur 1(a)). Uit de resultaten van de test van het hellend vlak bleek dat de maximale hoeken in de Tuina-groep hoger waren dan die in de HI-groep (figuur 1(b)), hetgeen wijst op een verbetering van de zwakte van de ledemaatsterkte in de Tuina-groep., De resultaten van de reflexen van het zenuwstelsel waren als volgt: bij de test van de loopreflexen begonnen de rattenjongen in de HI-groep zich met beide voorpoten aanzienlijk later uit de cirkel te bewegen dan die in de controlegroep en de Tuina-groep (figuur 1(c)). Bij de stillingsreflextest namen de ratten in de Tuina-groep minder tijd om zich te herstellen dan die in de HI-groep van P7 tot P11 (figuur 1(d)).
Tuina bevorderde de leer-en geheugenfuncties van hypoxisch-ischemische rattenpups.,
Morris water maze test en step-down test werden uitgevoerd om de leer-en geheugenfuncties van de ratten te evalueren. Zoals blijkt uit Figuur 2(a), tonen de motion tracks op de testdag van de MWM-test aan dat het aantal perronlocatieovergangen van de HI-groep aanzienlijk lager was dan dat van de controlegroep en de Tuina-groep (Figuur 2(b)). In de step-down test vertoonden de HI-ratten significant kortere latentietijd en meer fouten in vergelijking met de controlegroep en Tuina-ratten (Figuur 2(c) en 2(d)).
Tuina verhoogde 5 HMC-en Tet2-spiegels in de cerebrale temporale cortex van HI-ratten.,
om te onderzoeken of het niveau van 5 hmC werd beïnvloed tijdens de ontwikkeling van CP, voerden we dot blot tests uit en merkten we op dat het niveau van 5 HMC van HI ratten significant daalde ten opzichte van dat van de controle, terwijl dit niveau gedeeltelijk werd verhoogd na Tuina (; Figuur 3(a)). Ondertussen, toonde immunofluorescentie het bevlekken het samenvoegen van 5 hmC en DAPI het bevlekken aan en HI leidde tot daling van genomic 5 hmC in de linker temporale cortex, terwijl de Tuina behandeling 5 HMC niveau tot op zekere hoogte (Figuur 3(b)) herstelde, die in consistentie met de resultaten van punt het bevlekken was., Bovendien vertoonde de HI-groep, zoals blijkt uit Figuur 3(c) en 3(d), een verminderde Tet1-en Tet2-expressie in vergelijking met de controlegroep, terwijl alleen Tet2 na Tuina-therapie was verhoogd.
3.1. Genoombrede 5 hmc wijziging en distributie
om de exacte locatie en distributie van genoombrede 5 hmc te onderzoeken, werd hydroxymethyleerde DNA immunoprecipitatie (hMeDIP) gevolgd door Next-generation sequencing (hmedip-seq) uitgevoerd., De ratten, respectievelijk, uit controle (n = 3), HI (N = 3), en Tuina (n = 3) groepen werden opgeofferd op P31, en genomisch DNA van de linker temporale kwab cortex werd geëxtraheerd voor hmedip-seq. Het genoom-brede patroon van 5 HMC niveau werd geëvalueerd door 5 HMC-in kaart gebrachte leest in elke 10 kb bin van de steekproeven van de controle, Tuina, en HI groepen te tellen en dan genormaliseerd aan de totale het rangschikken dekking . Zoals getoond in Figuur 4 (A) -4(c), was de verdeling van het genoom-brede 5 hmC reads in de drie groepen verschillend, en dan hebben we verder de specifieke gengebieden onderzocht waarin deze verschillen bestaan., Figuur 4 (d) toont de overlappende eigenschappen van genormaliseerde dichtheid van 5 HMC leest met de bekende genomische eigenschappen op gedefinieerde genlichamen en CGI (CpG eilanden) volgens de UCSC tabel voor RGSC6.0/rn6. Verder, zoals getoond in Figuur 4(e), werden ook de distributies van 5 hmC op genlichamen en 1 kb omhoog – en stroomafwaarts van genlichamen bestudeerd., Uit Figuur 4 (d) en 4(e) blijkt dat het 5 hmC-niveau van de HI-groep verschilde van dat van de controlegroep en de Tuina-groep aan het 5′ – einde van het genomische lichaam, vooral op de plaatsen van ±500 bp van de transcriptionele startplaatsen (TSS) en de CGI binnen 500 bp van TSS.
3.2. Identificatie en annotatie van Differentially Hydroxymethylated Regions (DhMRs)
om de specifieke loci te lokaliseren die veranderde 5 HMC profielen vertonen, gingen we verder met het identificeren en karakteriseren van de specifieke Dhmr ‘ s van alle autosomen en geslachtschromosomen in het genoom., Interessant genoeg was er een groot verschil in de verdeling van hyper-DhMRs en hypo-DhMRs op het X-chromosoom (figuren 5(A)-5(c)). Om de biologische betekenis van de gevonden Dhmr ’s verder te onderzoeken, werden de genen verbonden aan deze Dhmr’ s geëxtraheerd voor de verrijkingsanalyse van de genontologie (GO)., Zoals getoond in Figuur 5 (d) en 5(e), gaf de go-verrijkingsanalyse aan dat deze hypo-Dhmr ‘ s in de HI-groep sterk verrijkt werden gevonden op de functionele routes met betrekking tot neuroontwikkeling en neuronale functies, met inbegrip van ontwikkelingscelgroei, neuronprojectie-uitbreiding, positieve regulatie van ontwikkelingsgroei, ontwikkelingsgroei betrokken bij morfogenese en gliaceldifferentiatie.,
Op basis van de uitgebreide analyse van de hydroxymethylatie differentiële genen lijsten van de drie groepen, selecteerden we zes hypo-DhMRs geassocieerde genen uit de HI-groep die alle geassocieerd waren met de functies van het zenuwstelsel om de relatie tussen 5 HMC veranderingen en transcriptieniveaus van deze genen te onderzoeken., Zoals verwacht werd vastgesteld dat, in overeenstemming met de verminderde 5 hmC-wijziging in Casd1, Prkg2 en Slc44a1, de overeenkomstige mRNA-gehalten ook significant waren verlaagd in de HI-groep in vergelijking met de controlegroep en de Tuina-groep (Figuur 5(f)).
4. Discussie
met het oog op algemene veiligheid en befaamde werkzaamheid wordt traditionele Chinese geneeskunde (TCM) gemakkelijk geaccepteerd door de algemene bevolking over de hele wereld. TCM is wijd toegepast in diverse pediatrische ziekten , zoals het sarcoom van Ewing , astma , de ziekte van Graves, en pediatrische allergische wanorde ., Ondertussen zijn er ook studies die erop wijzen dat TCM therapieën met inbegrip van Tuina, kruidengeneesmiddelen, en acupunctuur goed worden verdragen en positieve therapeutische effecten op hersenverlamming hebben . Vanwege de veelbelovende klinische resultaten en minder bijwerkingen, heeft Chinese Tuina massage groeiende interesse aangetrokken in termen van de behandeling van CP.
als nieuwe epigenetische modificatie dient hmC niet alleen als een tussenproduct van DNA-demethylatieprocessen, maar fungeert het ook als een stabiele epigenetische marker tijdens de ontwikkeling van verschillende ziekten ., 5 hmC is ongeveer tien keer meer verrijkt in neuronen dan in andere cellen en zijn dynamische regelgeving is kritiek in postnatale neurodevelopment . Bovendien is de verandering van het globale 5 HMC niveau beschouwd als nauw verwant aan vele neurodegeneratieve stoornissen en neurodevelopmental ziekten .
echter, naar ons beste weten, zijn weinig studies gericht op het verband tussen DNA-hydroxymethylatie en cerebrale parese, die de inspiratie voor ons onderzoek werd., In onze studie, de resultaten van Dot blotting en immunofluorescentie bleek dat de Globale 5 HMC niveau in de cerebrale temporale kwab cortex was significant verminderd na HI letsel, wat consistent is met de verminderde 5 HMC niveau in de muis nier na ischemie-reperfusie . Na behandeling met Tuina was de 5 hmC-spiegel in de Tuina-groep echter hoger dan die in de HI-groep., Verder is bekend dat 5 hmC wordt geproduceerd door oxidatie van 5 mC Door Tet-eiwitten, op basis waarvan we de niveaus van Tet1 en Tet2-eiwitten detecteerden en ontdekten dat beide niveaus significant verlaagd waren na HI-letsel, terwijl alleen Tet2-eiwit verhoogd was na Tuina-behandeling. In totaal impliceren deze bevindingen dat de verminderde Tet1-en Tet2-expressie kan bijdragen aan de afname van 5 hmC na HI-letsel en dat Tuina 5 HMC-niveau kan verhogen door de Tet2-expressie te verbeteren.,
integendeel, CGI methylering in promotors werd kritisch gevonden bij het tot zwijgen brengen van genen en 5 hmC kan een rol spelen in genexpressie gemedieerd door DNA-demethylering . In onze studie, toonde de HI groep verminderde verrijking van genoom-brede 5 hmC in CGI binnen 500 bp van TSS in vergelijking met controle en Tuina groepen, terwijl Tuina genoom-brede distributie van 5 hmC verhoogde., Ondertussen , in lijn met de vorige bevindingen dat de verrijking van 5 hmC in het genlichaam een sterke correlatie met de verhoogde transcriptie van de betrokken genen in neuronen kan hebben, toonden onze RT-PCR resultaten aan dat de uitputting van 5 HMC wijziging in prkg2, Casd1, en Slc44a1 gen gepaard ging met de verminderde mRNA niveaus van deze genen in de HI-groep., Op basis van al deze bevindingen hierboven vermeld, werd aangegeven dat 5 HMC modificatie een kritische rol kan spelen in de pathogenese van CP door het reguleren van transcriptie en expressie van de genen met betrekking tot neuronale functies en Tuina therapeutische effecten op CP kan produceren via het moduleren van 5 hmC.
interessanter is dat CP en gerelateerde ontwikkelingsstoornissen vaker worden gezien bij mannelijke patiënten en vrouwelijk neonataal muismodel met HI-hersenletsel vertoonde ook een geslachtsspecifiek lager voorkomen van CP , waarvan de reden nog onzeker is., Om de verstoring van deze mogelijke geslachtsspecifieke beschermende effecten te voorkomen, werden alleen mannelijke rattenpups geselecteerd voor onze studie. Opmerkelijk, in genoombrede cirkelkaart (Figuur 5 (a)), werden grote verschillen in de verdeling van hyper-DhMRs en hypo-DhMRs op het X chromosoom waargenomen uit de vergelijking tussen om het even welke twee groepen in onze studie, die verder de correlatie tussen geslacht en het voorkomen van hersenverlamming bevestigt., Met name vanwege de beperkingen van ons lab konden we geen IgG-controle doen of de inputbibliotheken genereren, en Dhmr ‘ s werden geïdentificeerd door de ene direct met de andere te vergelijken in plaats van te vergelijken met de input, die we zullen willen verbeteren in onze toekomstige studies om het onderzoek nauwkeuriger te maken.
verder toonden GO-analyses van hypo-DhMRs-geassocieerde genen in de HI-groep aan dat deze genen in hoge mate verrijkt zijn in meerdere signaalroutes gerelateerd aan neuroontwikkeling en neuronale functies., In ons experiment verschenen groeivertraging en neurologische ontwikkelingsstoornissen in de HI-groep in de vorm van gewichtsverlies, zwakte in ledemaatsterkte en verschillende neuronale reflexstoornissen die tot op zekere hoogte werden verbeterd door Tuina-behandeling. Bovendien, uit de resultaten van de Morris water doolhof test en step-down vermijden test, Tuina verbeterde leer-en geheugenfuncties van hypoxisch-ischemische ratten aanzienlijk., Deze resultaten wijzen op de correlatie tussen de verandering in 5-hydroxymethylcytosine loci en neuronale ontwikkeling en suggereren verder dat Tuina therapie hersenontwikkeling en cerebrale cognitieve functies kan beïnvloeden via modulerende DNA-hydroxymethylering.
in deze studie hebben we 5 HMC-kaarten van de controlegroepen, HI-en Tuina-groepen in het genoom verstrekt en hebben we veranderingen in de DNA-hydroxymethylatiestatus en 5 HMC-dynamische verandering na Tuina-behandeling aan het licht gebracht, wat licht kan werpen op het mogelijke therapeutische mechanisme van Tuina voor CP.,
beschikbaarheid van gegevens
de gegevens die zijn gebruikt ter ondersteuning van de bevindingen van deze studie zijn op verzoek verkrijgbaar bij de overeenkomstige auteur.
belangenconflicten
De auteurs verklaren dat er geen belangenconflicten zijn.
bijdragen van auteurs
Yunpeng Zhang en Chao Gao droegen eveneens bij aan dit werk.,
Dit werk werd ondersteund door de National Natural Science Foundation of China (81774444), Henan Province Science and Technology Research Project (182102310403), China-Canada Cooperative Clinical Research Project, Henan Province Study Abroad Program (201721), en Henan Province Medical Science and Technology Research Project (Provincial and Ministry Construction Project) (201701034).