att kunna skilja bakteriearter är viktigt av en mängd skäl, från att diagnostisera infektion eller kontrollera livsmedelssäkerhet, för att identifiera vilka arter det är som ger en ost det är fantastiskt karaktär. Bakteriearter, och även specifika stammar kan differentieras med hjälp av ett antal molekylära tekniker såsom PCR, kvantitativ PCR, genomsekvensering och masspektrometri., Men även utan att komma in i molekylär nitty gritty finns det fenotypiska skillnader mellan grupper av bakterier som kan användas för att skilja dem. Detta inkluderar egenskaper som deras form (till exempel baciller vs cocci), tillväxt i synnerhet näringsämnen och preferens för höga eller låga syremiljöer. Beroende på den egenskap som studeras kan bakteriearter delas upp i breda grupper, men sammantaget kan denna information begränsa de möjliga identiteterna kraftigt., En sådan användbar klassificering – om en bakterie är Gram positiv eller Gram negativ-är baserad på strukturen hos bakteriecellväggar.
skillnad i struktur av grampositiva mot gramnegativa bakterier
diagrammet nedan visar skillnaderna i strukturen hos grampositiva och gramnegativa bakterier. De två viktigaste funktionerna som leder till de olika visualiseringsegenskaperna hos Gram-positiva och Gram-negativa arter är tjockleken på peptidoglykanskiktet och närvaron eller frånvaron av det yttre lipidmembranet., Detta beror på att väggstrukturen påverkar cellens förmåga att behålla den kristallvioletta fläcken som används i Gram-färgningsproceduren, som sedan kan visualiseras under ett ljusmikroskop.
grampositiva bakterier har ett tjockt peptidoglykanlager och inget yttre lipidmembran medan gramnegativa bakterier har ett tunt peptidoglykanlager och har ett yttre lipidmembran.
eftersom grampositiva bakterier saknar ett yttre lipidmembran, kallas monodermer när de korrekt hänvisar till deras struktur snarare än färgningsegenskaper., Det yttre lipidmembranet som besitter gramnegativa bakterier innebär att de, när de hänvisar till sin fysiska struktur, kallas diderms.
Gramfärgningstekniken utvecklades 1884 av den danska bakteriologen Hans Christian Gram1. Medan ett Gram fläck inte kommer att berätta specifika arter du tittar på, det kan vara ett snabbt sätt att begränsa kraftigt listan över potentiella kandidater och direkt uppföljning testning där det behövs.,
Gram positiv vs Gram negativ fläck
Gram fläck förfarande – förbereda ett prov
1. Märk ett rent glasmikroskopglas med din providentifiering. Se till att du använder en penna så många bläck tas bort av reagenserna som används i färgningsproceduren.
2. Om du förbereder din bild från en flytande bakteriekultur:
Dab en liten droppkultur på gliden med en steril slinga. Smörj försiktigt droppen i en cirkelrörelse i ett område med ca 1 cm diameter., För mycket täta kulturer kan det vara nödvändigt att späda ut din kultur för att säkerställa att enskilda bakterieceller kan ses under ett mikroskop efter färgning.
om källmaterialet kommer från en bakterieplatta:
Återsuspendera en slinga av kolonimaterial i steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS) och fortsätt sedan som för en flytande kultur.
3. När smeten har lufttorkat, passera den utsmyckade gliden genom en flamma två eller tre gånger.
detta dödar mikroberna i smeten och fixar provet till bilden, var försiktig så att du inte överhettar provet, eftersom detta kan snedvrida cellulär morfologi.,
Gram stain procedure – Gram färgar ett prov
1. Fyll försiktigt smeten med kristallviolett och lämna i 1 minut. Luta gliden något och skölj försiktigt med kranvatten eller destillerat vatten.
kristallviolett är ett vattenlösligt färgämne som kommer in i peptidoglykanskiktet i bakteriecellväggen.
2. Fyll försiktigt smeten med grams jod och lämna i 1 minut. Luta gliden något och skölj försiktigt med kranvatten eller destillerat vatten. Smeten kommer nu att visas lila.,
grams jodlösning (jod och kaliumjodid) tillsätts för att bilda ett komplex med kristallvioletten, som är mycket större och är olöslig i vatten.
3. Avfärga smeten med 95% etylalkohol eller aceton. Luta gliden något och applicera alkoholdroppen droppe för droppe tills alkoholen går nästan klar (5-10 sekunder). Skölj omedelbart med vatten för att undvika överfärgning.
avfärgningsmedel dehydrerar peptidoglykanskiktet, krymper och stramar det., I Gram-positiva bakterier kan de stora kristallviolettjodkomplexen sedan inte tränga in och fly från det tjocka peptidoglykanskiktet, vilket resulterar i lila färgade celler. Men i gramnegativa bakterier bryts det yttre membranet, det tunna peptidoglykanskiktet kan inte behålla kristallviolettjodkomplexen och färgen förloras.
4. Fyll försiktigt med safranin mothåll och lämna i 45 sekunder. Luta gliden något och skölj försiktigt med kranvatten eller destillerat vatten.,
Safranin är svagt vattenlösligt och kommer att fläcka bakterieceller en ljusröd, vilket möjliggör visualisering av gramnegativa celler utan att störa observationen av lila av grampositiva celler.
5. Blot bilden torr på filterpapper sedan visa smeta med hjälp av ett ljus-mikroskop under olja-nedsänkning.
grampositiva mot gramnegativa färger
grampositiva bakterier
grampositiva bakterier har ett distinkt lila utseende när de observeras under ett ljusmikroskop efter Gramfärgning., Detta beror på retention av den lila kristallvioletta fläcken i cellväggens tjocka peptidoglykanskikt. Exempel på grampositiva bakterier inkluderar alla stafylokocker, alla streptokocker och vissa listeria-arter.
gramnegativa bakterier
gramnegativa bakterier uppträder en blek rödaktig färg när den observeras under ett ljusmikroskop efter Gramfärgning. Detta beror på att strukturen av deras cellvägg inte kan behålla kristall violett fläck så är färgade endast av safranin counterstain., Exempel på gramnegativa bakterier inkluderar enterokocker, salmonella arter och pseudomonas arter.
Gramfärgning kan inte användas på ett tillförlitligt sätt för att bedöma bakteriella fylogenetiska relationer. Det enda membranet av Gram-positiva arter tros vara förfädernas tillstånd. Historiskt hade man trott att det andra membranet som hittades på Gram-negativa bakterier utvecklades bara en gång och så var alla Gram-negativa arter närmare besläktade med varandra än de var till Gram-positiva arter., Men genetisk analys har sedan dess visat att detta inte är fallet och det är sannolikt att ha utvecklats flera gånger i olika lineages – en produkt av konvergent evolution.