Abstrakt
förutom abnormiteter i motor och hållning har barn med cerebral pares (CP) ofta intellektuell funktionsnedsättning. Som en kompletterande och alternativ traditionell kinesisk medicin (TCM) terapi, Kinesisk Tuina massage, även kallad Tuina i Kina, har länge använts i klinisk behandling för CP i Kina. Den molekylära grunden för detta är dock fortfarande i stort sett okänd., Nyligen har DNA-hydroximetylering visat sig vara känslig för miljön och spelar kritiska roller i vissa neurologiska störningar, medan forskningen som fokuserar på förhållandet mellan 5 HMC och Tuina-terapi för cerebral pares är bristfällig. I vår studie observerade vi först att Tuina förbättrade inlärnings-och minnesfunktioner hos hypoxisk-ischemiska (HI) råttvalpar. Under tiden minskade 5 HMC-nivån av den temporala loben cortex i Hi-neonatala råttmodellen signifikant jämfört med råttorna i kontroll-och Tuinagrupper., Sedan använde vi hMeDIP-Seq metod för att utforska om och hur DNA hydroxymethylation är inblandade i Tuina behandling för cerebral pares. Genomisk anteckning av DhMRs av Hi groups hypo-hydroximetylering till gener avslöjade anrikning i flera neurodevelopmental signaleringsvägar. Dessutom fann vi utarmningen av 5 HMC-modifieringar i gener associerade med neuronal utveckling åtföljdes av reducerade mRNA-nivåer av dessa gener., Tillsammans visar våra resultat att Tuina kan reglera uttrycket av neurodevelopmentrelaterade gener genom att ändra status för DNA-hydroximetylering, vilket förbättrar inlärnings-och minnesfunktionerna hos cerebral pares.
1. Inledning
hjärnskada som inträffar under perinatalperioden är en viktig orsak till förvärvad funktionsnedsättning., Förekomsten av hjärnskada hos spädbarn är korrelerad med flera faktorer, såsom hypoxi-ischemi, infektion, oxidativ stress och inflammatoriskt svar bland vilka hypoxi-ischemi (HI) kan inducera cerebral pares (CP) genom att utlösa perinatala cerebrala lesioner i prematura . CP är den vanligaste neonatala kroniska funktionshinder, som kännetecknas av motoriska och posturala försämringar, och åtföljs ofta av kognitiva och inlärningsunderskott . I grundvetenskapliga studier har Hi neonatal rat-modellen använts i stor utsträckning för att utforska beteendeutfall och patogenes av cerebral pares ., Trots den stora utvecklingen i CP-studier är de molekylära mekanismerna för hur hypoxi-ischemi bidrar till CP-utveckling och progression fortfarande oklara.
till denna dag innehåller de nuvarande terapierna för CP huvudsakligen ortopedisk kirurgi, antispasticitetsmedicin och olika typer av motorinlärningsinterventioner , varav de flesta bara arbetar för att behandla komplikationerna relaterade till CP och kan ge biverkningar., Traditionell kinesisk medicin (TCM), inklusive Tuina, akupunktur och örtmedicin, ensam eller kombinerad med konventionell terapi av västerländsk medicin, har dock använts i stor utsträckning som en alternativ behandling för CP i Kina . Tuina är en gammal form av medicinsk massage i kinesisk medicin, med applicerat fingertryck på akupunkturpunkter som är puttativt sensibiliserade av organsvikt . I synnerhet har Tuina, som ett säkrare och effektivare ingrepp, visat uppenbara effekter på cerebral pares i klinisk praxis. Den exakta mekanismen för hur Tuina fungerar på CP har dock ännu inte klarlagts.,
tvärtom har patogeniskt miljökänsliga epigenetiska modifieringar redan visat sig vara involverade i neurogenes , lärande och minne och synaptisk plasticitet . Bland olika epigenetiska modifieringar är DNA-metylering på det femte kolet av cytosin (5-metylcytosin, 5 mC) den mest omfattande studerade epigenetiska modifieringen som spelar viktiga roller i kromatinstruktur som omformas, transkriptionell undertryckning och cellulär differentiering ., Vidare föreslås oxidation av 5 mC till 5-hydroximetylcytosin (5 hmC) av ten-eleven translocation (TET) – genfamiljen som en ny mekanism för avlägsnande av 5 mC , och 5 hmC har föreslagits vara kritisk för att upprätthålla neuronstruktur och funktioner på grund av dess uppenbara anrikning i hjärnan . Under tiden identifieras 5 HMC-förändring också av många studier som är associerade med neurologiska störningar, såsom Alzheimers sjukdom , Rett-syndrom , bräckligt X-associerat tremor/ataxi syndrom , Huntingtons sjukdom och autismspektrumstörningarna ., Dessa bevis gav grunden för hypotesen att 5 HMC-förändringar kan spela kritiska roller i nervsystemet.,
för att undersöka förekomsten av involvering av Tuina-terapi i förändringen av 5 HMC i CP, tillämpade vi en etablerad kemisk märknings-och affinitetsreningsmetod i kombination med hög genomströmning sekvenseringsteknik för att avslöja de möjliga genomet-breda 5 hmC-förändringarna i Hi-råttor före och efter Tuina-behandling för att söka förhållandet mellan 5 HMC och Tuina terapeutiska effekter på CP, vilket ger bevis för att stödja tillämpningen av Tuina-terapi för cerebral pares.
2. Material och metoder
2.1., Djurmodell
alla experiment godkändes av etikkommittén för djurvård av Jinshan sjukhus ansluten till Fudan University. En modifierad ris-Vannucci-modell användes som tidigare beskrivits . Den neonatala HI-modellen utfördes på Sprague-Dawley manlig råtta valpar (Slac Laboratoriet Djur Företaget, Shanghai, Kina) på postnatal dag 3 (P3) via ligering av vänster gemensamma halspulsådern under 3% isofluran anestesi. Operationstiden för varje råtta kontrollerades inom 10 minuter., Efter återhämtning i 1 timme placerades dessa valpar i en hypoxikammare vid 37 ° C och var föremål för gasblandaren bestående av 8% O2 och 98% N2 i 3,5 timmar. Sham djur hade samma operation för att exponera den gemensamma halspulsådern utan ligering och hypoxi. Efter operationen återvände råttvalparna till sin hembur.
2.2. Tuina behandling
Tuina behandling utfördes av en specialiserad forskare med professionell läkare certifikat. Från dagen för P4 till P31 accepterade råttvalpar i Tuina-gruppen Tuina-intervention som utförs 120 gånger / min i 15 minuter, en gång om dagen.,f Tuina är följande: för det första var råttan placerad på manipulatorns vänstra hand för att anpassa sig till miljön; för det andra använde manipulatorn långfingeren på sin högra hand för att försiktigt gnugga råttan från nacken till svansen tre gånger för att slappna av sina muskler; för det tredje utfördes Tuina genom successiv gnidning, knådning och ett finger som tryckte längs råttans ryggrad från topp till botten och inifrån och ut på dorsum och ambilaterala ligament samt musklerna längs du meridian och blås meridian av råttan med hänvisning till relaterad traditionell kinesisk medicin (TCM) fungerar.,
2.3. Rätande Reflex
rätande reflex av neonatala råttor utvärderades från P5 till P11, såsom beskrivits tidigare . Under detta test placerades råttvalparna i en bakre position på en rengjord plan yta och tiden för dessa valpar att nå det benägna läget med alla fyra tassarna mättes.
2, 4. Gångreflex
Råttvalpar placerades i mitten av en vit rundad kartong (13 cm i diameter) och dagen då de flyttade av cirkeln med båda förbenen registrerades .
2, 5., Lutande Plantest
detta test användes för att mäta lemmarnas styrka genom att registrera den maximala vinkeln på lutningen på vilken råttvalparna fortfarande kan hantera grepp på dagen för P21, vilket visas i Figur 1 b . Under detta test placerades råttorna mot höger eller vänster och Planets vinkel ökade med 5 ° var femte sekund för att bestämma den maximala vinkeln på lutningen som råttan fortfarande kunde hålla.
2.6. Step-Down Avoidance Test
detta test genomfördes för att mäta lagring av minne . En råtta placerades försiktigt på en cylindrisk isoleringsplattform (4.,5 cm i diameter och höjd) i en konditioneringskammare för att anpassa sig till omgivningen i 3 min. När råttan steg ner plattformen, kommer den att elektrifieras omedelbart. I 5-minuters träningspass (P26) utbildades råttorna för att hoppa tillbaka på plattformen för att undvika elektrisk stimulering. I testsessionerna (24 h efter träning, dvs P27) registrerades latenstiden (tiden för råttorna att gå ner från plattformen för första gången) och antalet fel (frekvensen hos råttorna som steg ner från plattformen).
2.7., Morris Water Maze (MWM) Test
För att utvärdera rumsligt lärande och minne utfördes Morris water maze-testet i 5 dagar som tidigare beskrivits . Vatten labyrint (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, Kina) delades in i fyra kvadranter, och en plattform (5 cm i diameter) placerades 1 cm under vattenytan i en kvadrant. I träningssessionerna (P27–P30) utbildades alla råttor fyra gånger om dagen i fyra på varandra följande dagar, och de fick hitta den dolda plattformen inom 60 s., Om råttan misslyckades med att hitta plattformen inom 60 s, leddes den försiktigt till plattformen och fick stanna på den i 30 s innan den skickades tillbaka till buret. På dagen för spatial probe trial (P31) togs plattformen bort och råttorna släpptes i vattnet mot poolväggen från samma position som i träningssessionerna. Därefter registrerades rörelsespåren och antalet plattformsplatsövergångar.
2.8., Dot Blotting
Efter slutförandet av ovanstående tester offrades råttvalparna på P31 och deras hjärnor dissekerades för att samla den totala DNA i vänster temporal cortex av en QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Tyskland). 2,5 µL genomiskt DNA (100 ng/µL) sågs på nylonmembran följt av bakning vid 80°C i 30 min till tvärlänk DNA . Efter blockering med 5% fettfri mjölk för 1 h vid rumstemperatur inkuberades membranet med polyklonal 5 HMC-antikropp (1: 1000 utspädning, aktivt motiv, USA, katt. Nej., 39769) vid 4 ° C över natten och pepparrotperoxidas (HRP)-konjugerad sekundär antikropp användes för att sondera nästa dag. Dot blot-membranet färgades med 0.02% metylenblått (MB) för att säkerställa lika belastning.
2, 9. Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation (hMeDIP) Analys och Hög Genomströmning Sekvensering
Genomiskt DNA extraherades från vänster temporala cortex råtta valpar (kontroll n = 3, HI: n = 3; Tuina: n = 3) och sonicated till 200-350 baspar (bp). Och DNA-fragmenten var slut reparerade; a-tailed och Illumina Adaptrar ligerades., Därefter denatureras och inkuberas adapterligerat DNA med 5 HMC-antikroppar (aktivt motiv, USA, katt. Nr 39769) vid 4°C över natten. Antikropp-DNA komplex fångades av protein A/G pärlor. Den immunoprecipiterade DNA renades och genomgick hög genomströmning sekvensering utförs på Illumina HiSeq3000 systemet (Illumina, USA) .
2, 10. Kartläggning av sekvenseringsdata och bioinformatik
bearbetning av sekvenseringsdata utfördes som beskrivits tidigare . FASTQ-sekvensfiler efter biologiska dupliceringar var inriktade på UCSC rat-referensgenomet (RGSC6.0/rn6) ., Unique, nonduplicate reads användes för peak calling och annotation av hypergeometrisk optimering av motiv anrikning (HOMER) . 5-HMC anrikning toppar bestämdes med hjälp av en modellbaserad analys av ChIP-Seq (MACS) programvara . Och differentiellt hydroximetylerade regioner (DhMRs) identifierades bland alla par av 5-hmC-berikade prover genom att direkt jämföra ett prov med ett annat i alla riktningar . Gene ontologi (GO) analyser utfördes med hjälp av DAVID .
2, 11. Kvantitativ RT-PCR
Total RNA extraherades från den vänstra temporala loben cortex., Omvänd transkription av cDNA utfördes med hjälp av PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japan). Kvantitativa RT-PCR-reaktioner utfördes på 7500 realtids PCR-system (Applied Biosystems, USA) med hjälp av SYBR green (Takara, Japan). β-aktin användes som en intern kontroll, och relativ uttryck av målgenen bestämdes av 2−ΔΔCT-metoden., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
den isolerade vänstra temporal lobe cortex tillsattes med iskallt proteinlysat och centrifugerades vid 12000 r/min i 20 min vid 4°C. proteinprover separerades genom elektrofores med användning av SDS-PAGE och överfördes till PVDF-membran (Millipore, USA). Efter blockering med 5% fettfri mjölk i 2 timmar vid rumstemperatur inkuberades membranen med de primära antikropparna vid 4 ° C över natten och inkuberades sedan med HRP-konjugerade sekundära IgG-antikroppar. De primära antikropparna som används här inkluderade anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. Nej., 191698), anti-Tet2 (1 : 1000, Millipore, Förenta Staterna, katt. # ABE364), anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, STORBRITANNIEN, Katt. 110767) och anti-β tubulin (1 : 2000, Cell Signaling Technology, USA, Kat. #2128). Membranen utvecklades sedan med ECL-detektering, och signalerna detekterades med Tanon-5200 Chemiluminescent Imaging System (Tanon, Shanghai, Kina). Proteinnivåerna analyserades av Image J software (NIH, Bethesda, USA) och normaliserades till motsvarande β-tubulinnivå.
2.13., Immunofluorescenskonfokalmikroskopi
Råttvalpar offrades på P31, och deras hjärtan perforerades med 0, 9% saltlösning följt av 4% paraformaldehyd (PFA). Efter perfusion dissekerades hjärnorna och fixerades i 4% PFA över natten följt av att vara inbäddad i paraffin och gjord i 5 µm seriella sektioner. Efter mikrovågsantigenshämtning i citronsyrabuffert vid 95°c blockerades icke-specifika platser med 5% bovint serumalbumin (BSA) för 1 h vid rumstemperatur. Därefter inkuberades hjärnsektionerna med 5 HMC-primär antikropp (1: 1000, aktivt motiv, USA, katt. Nej., 39769) över natten vid 4 ° C följt av inkubation med den sekundära antikroppen (1: 200, Life Technology, USA) 1 h vid 37°C. 4′,6-diamino-2-fenylindol (DAPI) användes för nukleär immunofluorescensfärgning, och immunofluorescensbilderna visualiserades och fångades på ett konfokalmikroskop (Leica sp5, Tyskland).
2.14. Statistisk analys
Alla data uttrycktes som medelvärdet ± standardfel för medelvärdet (SEM) och analyserades med hjälp av SPSS., Envägsanalys av varians (ANOVA) applicerades för att bestämma skillnaderna mellan de 3 grupperna, följt av nonparametrisk t-test och Tukey ärligt signifikant skillnad test. värde < 0,05 ansågs statistiskt signifikant.
3. Resultat
Tuina förbättrad viktminskning, svaghet i Lem styrka, och störningar i neurologiska reflexer inducerad av HI.,
kroppsvikt hos råttvalpar mättes från P4 till P28, och det konstaterades att från P22 till P28 ökade kroppsvikten hos råttorna i Tuina-gruppen (n = 11) signifikant jämfört med HI-gruppen (N = 11; Figur 1(A)). Resultaten av det lutande plantestet visade att de maximala vinklarna var högre i Tuina-gruppen än de i HI-gruppen (Figur 1(B)), vilket indikerade förbättring av svagheten hos Lemmens styrka i Tuina-gruppen., Resultaten av nervsystemreflexer var följande: i gångreflextestet började råttvalparna i HI-gruppen flytta sig från cirkeln med båda förben betydligt senare än de i kontroll-och Tuinagrupper(Figur 1 (C)). I det rätande reflextestet tog råttorna i Tuina-gruppen kortare tid att rätta sig än de i HI-gruppen från P7 till P11 (Figur 1(D)).
tuina främjade inlärnings-och minnesfunktioner hos hypoxisk-ischemiska råttvalpar.,
Morris water maze test och step-down test utfördes för att utvärdera inlärnings-och minnesfunktionerna hos råttorna. Som visas i Figur 2(A) visar rörelsespåren på provdagen för MWM-testet att antalet plattformsplatsövergångar i HI-gruppen var betydligt mindre än för kontrollgruppen och Tuina-gruppen (Figur 2(B)). I den step-down-test, HI råttor visade signifikant kortare latenstid och fler fel jämfört med kontroll och Tuina råttor (Figur 2 c och 2 d).
Tuina ökade 5 HMC-och Tet2-nivåer i hjärnbarken hos HI-råttor.,
för att undersöka om nivån på 5 hmC påverkades under CP-utvecklingen utförde vi dot blot-tester och observerade att 5 HMC-nivån av Hi-råttor minskade signifikant jämfört med kontrollnivån, medan denna nivå delvis ökade efter Tuina (; Figur 3(a)). Under tiden visade immunofluorescensfärgning sammanslagningen av 5 HMC och DAPI-färgning och HI ledde till minskning av genomisk 5 HMC i vänster temporal cortex, medan Tuina-behandling återställde 5 HMC-nivå till viss del (Figur 3(B)), vilket var i överensstämmelse med resultaten av dot blotting., Som framgår av figurerna 3 C och 3 D visade HI-gruppen dessutom minskat Tet1-och tet2-uttryck jämfört med kontrollgruppen, medan endast Tet2 ökade efter Tuina-behandling.
3.1. Genome-Wide 5 hmc Förändring och Distribution
för Att undersöka exakt var och distribution av genome-wide 5 hmc, hydroxymethylated DNA immunoprecipitation (hMeDIP) följt av nästa generations sekvensering (hMeDIP-seq) genomfördes., Råttorna, respektive, från kontroll (n = 3), HI (n = 3), och Tuina (n = 3) grupper offrades på P31, och genomisk DNA av den vänstra temporala loben cortex extraherades för hMeDIP-seq. Genomet-brett mönster av 5 HMC-nivå utvärderades genom att räkna 5 hmC-mappade läser i varje 10 kb bin från proverna av kontroll -, Tuina-och HI-grupperna och normaliserades sedan till den totala sekvenstäckningen . Som visas i figurerna 4(A)-4(c), fördelningen av genomet-wide 5 HMC läser i de tre grupperna var annorlunda, och sedan vi ytterligare utforskade de specifika genregioner där dessa skillnader finns., Figur 4 (d) visar de överlappande egenskaperna hos normaliserad densitet av 5 HMC läser med de kända genomiska egenskaperna på definierade genkroppar och CGI (CpG islands) enligt UCSC-tabellen för RGSC6.0/rn6. Vidare, såsom visas i Figur 4(e), studerades också distributionerna av 5 HMC vid genkroppar och 1 kb upp – och nedströms av genkroppar., Det kan observeras från figurerna 4 (d) och 4 (e) att HI-gruppens 5 HMC-nivå skilde sig från kontrollgruppen och Tuina-gruppen vid 5-änden av genomkroppen, särskilt på platserna ±500 bp av transkriptionsstationsplatserna (TSS) och CGI inom 500 bp av TSS.
3.2. Identifiering och Uppmärkning av Differentiellt Hydroxymethylated Regioner (DhMRs)
för Att lokalisera specifika loci som uppvisar en förändrad 5 hmC profiler, fortsatte vi att identifiera och karaktärisera de särskilda DhMRs av alla autosomes och sex kromosomer i hela genomet., Intressant var det stor skillnad i fördelningen av hyper-DhMRs och hypo-dhmrs på X-kromosomen(figurerna 5(a)-5 (C)). För att ytterligare utforska den biologiska betydelsen av de funna DhMRs extraherades generna associerade med dessa DhMRs för Gen ontologi (GO) anrikning analys., Såsom visas i figurerna 5(d) och 5(e), GO anrikning analys indikerade att dessa hypo-DhMRs i HI-gruppen befanns mycket berikad på de funktionella vägar relaterade till neurodevelopment och neuronala funktioner, inklusive utvecklings celltillväxt, neuron projektion förlängning, positiv reglering av utvecklingstillväxt, utvecklingstillväxt involverade i morfogenes, och glial celldifferentiering.,
baserat på den omfattande analysen av hydroximetyleringsdifferentialgener listor över de tre grupperna, valde vi sex hypo-DhMRs associerade gener från HI-gruppen som alla var associerade med funktionerna i nervsystemet för att undersöka förhållandet mellan 5 HMC-förändringar och transkriptionsnivåer av dessa gener., Som förväntat konstaterades det att motsvarande mRNA-nivåer i HI-gruppen, i enlighet med den reducerade 5 HMC-ändringen i Casd1, Prkg2 och Slc44a1, också minskade betydligt jämfört med nivåerna i kontroll-och Tuinagrupper (Figur 5 f).
4. Diskussion
med allmän säkerhet och välrenommerad effekt accepteras traditionell kinesisk medicin (TCM) lätt av den allmänna befolkningen över hela världen. TCM har använts i stor utsträckning i olika pediatriska sjukdomar , såsom Ewings sarkom , astma , Graves sjukdom och pediatriska allergiska störningar ., Samtidigt finns det också studier som indikerar att TCM-terapier inklusive Tuina, växtbaserade läkemedel och akupunktur tolereras väl och har positiva terapeutiska effekter på cerebral pares . På grund av de lovande kliniska resultaten och färre biverkningar har kinesisk Tuina massage lockat växande intresse när det gäller behandling för CP.
som en ny epigenetisk modifiering tjänar 5 hmC inte bara som en mellanprodukt av DNA-demetyleringsprocesser utan fungerar också som en stabil epigenetisk markör under utveckling av olika sjukdomar ., 5 hmC är ungefär tiofaldigt mer berikad i neuroner än i andra celler och dess dynamiska reglering är kritisk i postnatal neurodevelopment . Dessutom har förändringen av den globala 5 hmC-nivån ansetts vara nära relaterad till många neurodegenerativa störningar och neurodevelopmental sjukdomar .
såvitt vi vet har dock få studier fokuserats på sambandet mellan DNA-hydroximetylering och cerebral pares, vilket blev inspirationen till vår forskning., I vår studie visade resultaten av dot blotting och immunofluorescens att den globala 5 HMC-nivån i hjärnbarken i hjärnbarken minskade signifikant efter HI-skada, vilket överensstämmer med den reducerade 5 hmC-nivån i musnjuren efter ischemi-reperfusion . Men efter Tuina-behandling var 5 HMC-nivån i Tuina-gruppen högre än i HI-gruppen., Det är dessutom känt att 5 hmC framställs genom oxidation av 5 mC med Tet proteiner, som bygger på vilka vi upptäckte nivåer av Tet1 och Tet2 proteiner och fann att båda nivåerna var signifikant minskade efter HI skada, medan endast Tet2 protein ökade efter Tuina behandling. Sammantaget innebär Dessa resultat att det reducerade Tet1-och tet2-uttrycket kan bidra till minskningen av 5 hmC efter HI-skada och Tuina kan öka 5 HMC-nivån genom att öka Tet2-uttrycket.,
tvärtom befanns CGI-metylering i promotorer kritisk i genljuddämpning och 5 hmC kan spela en roll i genuttryck medierad av DNA-demetylering . I vår studie visade HI-gruppen minskad anrikning av genomomsomfattande 5 HMC i CGI inom 500 bp av TSS jämfört med kontroll-och Tuina-grupper, medan Tuina ökade genomomsomfattande distribution av 5 hmC., Samtidigt , i linje med de tidigare resultaten att anrikningen av 5 hmC i genkroppen kan ha en stark korrelation med den ökade transkriptionen av de berörda generna i neuroner, visade våra RT-PCR-resultat att utarmningen av 5 hmC-modifiering i Prkg2, Casd1 och Slc44a1-genen åtföljdes av de reducerade mRNA-nivåerna av dessa gener i HI-gruppen., Baserat på alla dessa fynd som nämnts ovan indikerades det att 5 HMC-modifiering kan spela en kritisk roll i patogenesen av CP genom att reglera transkription och uttryck av generna relaterade till neuronala funktioner och Tuina kan ge terapeutiska effekter på CP via modulering 5 HMC.
mer intressant visade det sig att CP och relaterade utvecklingsstörningar är vanligare hos manliga patienter och kvinnlig neonatal musmodell av Hi-hjärnskada visade också könsspecifik lägre förekomst av CP , orsaken till vilken fortfarande är osäker., För att undvika störningar från dessa möjliga könsspecifika skyddande effekter valdes endast manliga råttvalpar ut för vår studie. Anmärkningsvärt, i genome-wide cirkulära kartan (Figur 5(a)) är stora skillnader i fördelningen av hyper-DhMRs och hypo-DhMRs på X-kromosomen observerades från en jämförelse mellan två grupper i vår studie, vilket ytterligare bekräftar sambandet mellan kön och förekomsten av cerebral pares., På grund av begränsningarna i vårt labb kunde vi inte göra IgG-kontroll eller generera ingångsbiblioteken, och DhMRs identifierades genom att direkt jämföra den ena med den andra snarare än att jämföra med ingången, som vi kommer att ha för avsikt att förbättra i våra framtida studier för att göra forskningen mer exakt.
vidare visade GO-analyser av hypo-DhMRs-associerade gener i HI-gruppen att dessa gener är mycket berikade i flera signalvägar relaterade till neurodevelopment och neuronala funktioner., I vårt experiment uppträdde tillväxthämning och neurodevelopmental disorders i HI-gruppen i form av viktminskning, svaghet i Lem styrka och flera neuronala reflexstörningar som förbättrades av Tuina-behandling i viss utsträckning. Dessutom, från resultaten av Morris water maze test och step-down avoidance test, förbättrade Tuina inlärnings-och minnesfunktioner hos hypoxiska-ischemiska råttor signifikant., Dessa resultat indikerar korrelationen mellan förändringen i 5-hydroximetylcytosin loci och neuronal utveckling och föreslår vidare att Tuina-terapi kan påverka hjärnans utveckling och cerebrala kognitiva funktioner via modulerande DNA-hydroximetylering.
i denna studie tillhandahöll vi genom-omfattande 5 HMC-kartor över kontroll -, HI-och Tuina-grupper och avslöjade förändring i DNA-hydroximetyleringsstatus och 5 HMC-dynamisk förändring efter Tuina-behandling, vilket kan belysa den möjliga terapeutiska mekanismen för Tuina för CP.,
datatillgänglighet
de data som används för att stödja resultaten av denna studie är tillgängliga från motsvarande författare på begäran.
intressekonflikter
författarna förklarar att det inte finns några intressekonflikter.
författarnas bidrag
Yunpeng Zhang och Chao Gao bidrog lika till detta arbete.,
Tack
Detta arbete är finansierat av National Natural Science Foundation of China (81774444), Henan-Provinsen Science and Technology Research Project (182102310403), Kina-Kanada Kooperativa Kliniska forskningsprojekt, Henan-Provinsen Studera Utomlands Program (201721), och Henan-Provinsen Medicinsk Forskning inom Naturvetenskap och Teknologi-Projektet (Regionala och Ministeriet byggprojekt) (201701034).