resumen
Además de las anomalías motoras y de la postura, los niños con parálisis cerebral (PC) a menudo tienen discapacidad intelectual. Como terapia complementaria y alternativa de Medicina Tradicional China (MTC), el masaje chino de Tuina, también llamado Tuina en China, se ha aplicado ampliamente en el tratamiento clínico para la parálisis cerebral en China durante mucho tiempo. Sin embargo, la base molecular de esto sigue siendo en gran medida desconocida., Recientemente, la hidroximetilación del ADN ha demostrado ser sensible al medio ambiente y juega un papel crítico en algunos trastornos neurológicos, mientras que la investigación que se centra en la relación entre 5 hmC y la terapia de Tuina para la parálisis cerebral es deficiente. En nuestro estudio, observamos por primera vez que Tuina mejoró las funciones de aprendizaje y memoria de las crías de rata hipóxico-isquémica (HI). Mientras tanto, el nivel 5 hmC de la corteza del lóbulo temporal en el modelo de rata neonatal HI disminuye significativamente en comparación con el de las ratas en los grupos control y Tuina., Luego, utilizamos el método hMeDIP-Seq para explorar si y cómo la hidroximetilación del ADN está involucrada en la terapia con Tuina para la parálisis cerebral. La anotación genómica de DhMRs de hipo-hidroximetilación del grupo A genes reveló enriquecimiento en múltiples vías de señalización del neurodesarrollo. Además, encontramos que el agotamiento de 5 modificaciones hmC en genes asociados con el desarrollo neuronal fue acompañado por niveles reducidos de ARNm de estos genes., En conjunto, nuestros resultados indican que Tuina puede regular la expresión de genes relacionados con el neurodesarrollo al cambiar el estado de la hidroximetilación del ADN, mejorando así las funciones de aprendizaje y memoria de la parálisis cerebral.
1. Introducción
la lesión Cerebral que ocurre durante el período perinatal es una causa importante de discapacidad adquirida., La ocurrencia de lesión cerebral en bebés se correlaciona con múltiples factores, como hipoxia-isquemia, infección, estrés oxidativo y respuesta inflamatoria, entre los cuales la hipoxia-isquemia (HI) puede inducir parálisis cerebral (PC) al desencadenar lesiones cerebrales perinatales en pretérmino . La PC es la discapacidad crónica neonatal más común, caracterizada por deficiencias motoras y posturales, y a menudo va acompañada de déficits cognitivos y de aprendizaje . En estudios de Ciencias Básicas, el modelo de ratas neonatales HI ha sido ampliamente utilizado para explorar los resultados conductuales y la patogénesis de la parálisis cerebral ., A pesar del Gran Avance en los estudios de PC, los mecanismos moleculares de cómo la hipoxia-isquemia contribuye al desarrollo y progresión de la PC aún no están claros.
hasta el día de hoy, las terapias actuales para la PC incluyen principalmente Cirugía Ortopédica, medicamentos antiespasticidad y varios tipos de intervenciones de aprendizaje motor , la mayoría de las cuales simplemente funcionan para tratar las complicaciones relacionadas con la PC y pueden provocar efectos secundarios., Sin embargo, la medicina tradicional china (MTC), incluida la Tuina, la acupuntura y la medicina herbal, sola o combinada con la terapia convencional de la medicina occidental, se ha utilizado ampliamente como un tratamiento alternativo para la parálisis cerebral en China . Tuina es una antigua forma de masaje médico en la medicina china, con la presión de los dedos aplicados a los puntos de acupuntura que son supuestamente sensibilizados por el deterioro de los órganos . Cabe destacar que Tuina, como intervención más segura y eficaz, ha mostrado efectos evidentes sobre la parálisis cerebral en la práctica clínica. Sin embargo, el mecanismo exacto de cómo funciona Tuina en PC aún no se ha dilucidado.,
por el contrario, patogénicamente , las modificaciones epigenéticas sensibles al medio ambiente ya han demostrado estar involucradas en la neurogénesis , el aprendizaje y la memoria, y la plasticidad sináptica . Entre varias modificaciones epigenéticas, la metilación del ADN en el quinto carbono de la citosina (5-metilcitosina, 5 mC) es la modificación epigenética más ampliamente estudiada que desempeña un papel importante en el remodelado de la estructura de la cromatina, la supresión transcripcional y la diferenciación celular ., Además, la oxidación de 5 mC en 5-hidroximetilcitosina (5 hmC) por la familia de genes de translocación ten-eleven (TET) se propone como un nuevo mecanismo para la eliminación de 5 mC , y se ha sugerido que 5 hmC es crítico en el mantenimiento de la estructura y las funciones neuronales debido a su obvio enriquecimiento en el cerebro . Mientras tanto, la alteración 5 hmC también se identifica en muchos estudios como asociada con trastornos neurológicos, como la enfermedad de Alzheimer , el síndrome de Rett , el síndrome de temblor/ataxia asociado al cromosoma X frágil , la enfermedad de Huntington y los trastornos del espectro autista ., Estas evidencias proporcionaron la base para la hipótesis de que 5 alteraciones hmC pueden jugar un papel crítico en la enfermedad del sistema nervioso.,
para explorar la presencia de la implicación de la terapia de Tuina en la alteración de 5 hmC en la PC, se aplicó un método de purificación de afinidad y etiquetado químico establecido junto con tecnología de secuenciación de alto rendimiento para revelar las posibles alteraciones de 5 hmC en todo el genoma en ratas HI antes y después del tratamiento con Tuina con el fin de buscar la relación entre 5 hmC y los efectos terapéuticos de Tuina en la PC, proporcionando así evidencia para apoyar la aplicación de la terapia de Tuina para la parálisis cerebral.
2. Materiales y Métodos
2.1., Modelo Animal
Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética para el cuidado Animal del Hospital Jinshan afiliado a la Universidad de Fudan. Se utilizó un modelo modificado de Rice-Vannucci como se describió anteriormente . El modelo de HI neonatal se realizó en crías de rata macho Sprague-Dawley (Slac Laboratory Animal Company, Shanghai, China) en el día 3 postnatal (P3) mediante ligadura de la arteria carótida común izquierda bajo anestesia con isoflurano al 3%. El tiempo de cirugía para cada rata se controló en 10 minutos., Después de la recuperación por 1 hora, estas crías se colocaron en una cámara de hipoxia a 37°C y se sometieron al mezclador de gas compuesto por 8% de O2 y 98% de N2 durante 3,5 horas. Los animales simulados tuvieron la misma operación para exponer la arteria carótida común sin ligadura e hipoxia. Después de la cirugía, las crías de rata fueron devueltas a su jaula de origen.
2.2. Tratamiento de Tuina
El tratamiento de Tuina fue realizado por un investigador especializado con certificado médico profesional. Desde el día de P4 hasta P31, las crías de rata en el grupo de Tuina aceptaron la intervención de Tuina que se realiza 120 veces / min durante 15 minutos, una vez al día.,f Tuina es la siguiente: en primer lugar, la rata se colocó en la palma de la mano izquierda del manipulador para ajustarse al medio ambiente; en segundo lugar, el manipulador usó el dedo medio de su mano derecha para frotar suavemente a la rata desde el cuello hasta la cola tres veces para relajar sus músculos; en tercer lugar, Tuina se llevó a cabo frotando, amasando y empujando con un dedo a lo largo de la columna vertebral de las ratas de arriba a abajo y de adentro hacia afuera en el dorso y los ligamentos ambilaterales, así como los músculos a lo largo del meridiano de du y el meridiano de la vejiga de la rata con referencia a la medicina tradicional china relacionada (TCM) funciona.,
2.3. Reflejo de corrección
el reflejo de corrección de ratas recién nacidas se evaluó de P5 a P11, como se describió anteriormente . Durante esta prueba, las crías de rata se colocaron en posición supina sobre una superficie plana limpia y se midió el tiempo para que estas crías alcanzaran la posición prona con las cuatro patas.
2.4. Reflejo de la marcha
Las crías de rata se colocaron en el Centro de un cartón blanco redondeado (13 cm de diámetro), y se registró el día en que se retiraron del círculo con ambas extremidades anteriores .
2.5., Prueba de plano inclinado
esta prueba se utilizó para medir la fuerza de la extremidad registrando el ángulo máximo de la pendiente en el que las crías de rata todavía pueden agarrar el día de P21, como se muestra en la Figura 1(b) . Durante esta prueba, las ratas se colocaron mirando hacia la derecha o hacia la izquierda y el ángulo del plano se aumentó en 5° cada cinco segundos para determinar el ángulo máximo de la pendiente a la que la rata todavía podía sujetarse .
2.6. Prueba de evitación reductora
esta prueba se implementó para medir la retención de memoria . Se colocó suavemente una rata en una plataforma de aislamiento cilíndrica (4.,5 cm de diámetro y altura) en una cámara de acondicionamiento para adaptarse al entorno durante 3 min. Una vez que la rata baje por la plataforma, será electrificada inmediatamente. En la sesión de entrenamiento de 5 minutos (P26), las ratas fueron entrenadas para saltar de nuevo a la plataforma para evitar la estimulación eléctrica. En las sesiones de prueba (24 h después del entrenamiento, es decir, P27), se registró el tiempo de latencia (el tiempo para que las ratas bajen de la plataforma por primera vez) y el número de errores (frecuencia de las ratas que bajan de la plataforma).
2.7., Prueba de laberinto de agua de Morris (MWM)
con el fin de evaluar el aprendizaje espacial y la memoria, se realizó la prueba de laberinto de agua de Morris durante 5 días como se describió anteriormente . El laberinto de agua (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, China) se dividió en cuatro cuadrantes, y una plataforma (5 cm de diámetro) se colocó 1 cm por debajo de la superficie del agua en un cuadrante. En las sesiones de entrenamiento (P27-P30), todas las ratas fueron entrenadas cuatro veces al día durante cuatro días consecutivos, y se les permitió encontrar la plataforma oculta dentro de los 60 s., Si la rata no pudo encontrar la plataforma dentro de los 60 s, fue guiada suavemente a la plataforma y se le permitió permanecer en ella durante 30 s antes de ser enviada de vuelta a la jaula. El día del ensayo spatial probe (P31), se retiró la plataforma y las ratas fueron liberadas al agua frente a la pared de la piscina desde la misma posición que en las sesiones de entrenamiento. Subsequently, the motion tracks and the number of platform location crossings were recorded.
2.8., Dot Blotting
Después de completar las pruebas anteriores, las crías de rata fueron sacrificadas en P31 y sus cerebros fueron diseccionados para recoger el ADN total de la corteza temporal izquierda mediante un Mini Kit de ADN QIAamp (Qiagen, Alemania). Se observó ADN genómico de 2,5 µL (100 ng/µL) en membranas de nylon, seguido de cocción a 80°C durante 30 minutos para el enlace cruzado del ADN . Después del bloqueo con leche descremada al 5% durante 1 h a temperatura ambiente, la membrana se incubó con anticuerpo policlonal 5 hmC (dilución 1 : 1000, motivo activo, Estados Unidos, Cat. No., 39769) a 4°C durante la noche y el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) se utilizó para sondear al día siguiente. La membrana dot blot se tiñó con un 0,02% de azul de metileno (MB) para garantizar una carga igual.
2.9. El análisis de inmunoprecipitación de ADN hidroximetilado (hMeDIP) y secuenciación de alto rendimiento
se extrajo ADN genómico de la corteza temporal izquierda de crías de rata (control: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) y se sonicó a 200-350 pares de bases (bp). Y los fragmentos de ADN fueron reparados; adaptadores de cola A E Illumina fueron unidos., Luego, el ADN ligado por adaptador fue desnaturalizado e incubado con 5 anticuerpos hmC (Active Motif, Estados Unidos, Cat. Nº 39769) a 4°C durante la noche. Los complejos anticuerpo-ADN fueron capturados por perlas de proteína a/G. El ADN inmunoprecipitado se purificó y se sometió a una secuenciación de alto rendimiento realizada en el sistema Illumina HiSeq3000 (Illumina, Estados Unidos) .
2.10. Mapeo de datos de secuenciación y Bioinformática
El Procesamiento de datos de secuenciación se realizó como se describió anteriormente . Los archivos de secuencia FASTQ después de duplicaciones biológicas se alinearon con el genoma de referencia de rata UCSC (RGSC6. 0 / rn6)., Se utilizaron lecturas únicas y no duplicadas para la llamada de picos y la anotación mediante la optimización hipergeométrica del enriquecimiento de motivos (HOMER) . Los Picos de enriquecimiento 5-hmC se determinaron utilizando un análisis basado en modelos del software ChIP – SEQ (MACS). Y se identificaron regiones diferencialmente hidroximetiladas (DhMRs) entre todos los pares de muestras enriquecidas con 5-hmC comparando directamente una muestra con otra en todas las direcciones . Los análisis de ontología génica (GO) se realizaron utilizando el DAVID .
2.11. El ARN total cuantitativo RT-PCR
se extrajo de la corteza del lóbulo temporal izquierdo., La transcripción inversa del ADNc se realizó utilizando el PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japón). Las reacciones cuantitativas de RT-PCR se realizaron en el sistema de PCR en tiempo real 7500 (Applied Biosystems, Estados Unidos) utilizando SYBR green (Takara, Japón). La β-actina fue utilizada como control interno, y la expresión relativa del gen diana fue determinada por el método 2−ΔΔCT., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
la corteza aislada del lóbulo temporal izquierdo se añadió con Lisado de proteína fría y se centrifugó a 12000 r / min durante 20 min a 4 ° C. Las muestras de proteína se separaron mediante electroforesis utilizando SDS-PAGE y se transfirieron a membranas de PVDF (Millipore, Estados Unidos). Después del bloqueo con leche descremada al 5% durante 2 h a temperatura ambiente, las membranas se incubaron con los anticuerpos primarios a 4°C durante la noche y luego se incubaron con anticuerpos IgG secundarios conjugados con HRP. Los anticuerpos primarios utilizados aquí incluyeron anti-Tet1 (1: 1000, Abcam, Reino Unido, Cat. No., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, United States, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1: 1000, Abcam, UK, Cat. No. 110767), y anti-β tubulin (1: 2000, Cell Signaling Technology, Estados Unidos, Cat. #2128). Las membranas se desarrollaron utilizando la detección de ECL, y las señales se detectaron con el sistema de imágenes Quimioluminiscentes Tanon-5200 (Tanon, Shanghai, China). Los niveles de proteína fueron analizados por el software Image J (NIH, Bethesda, EE.UU.) y normalizados al nivel de β-tubulina correspondiente.
2.13., Microscopía confocal de inmunofluorescencia
se sacrificaron crías de rata en P31, y sus corazones se perfundieron con solución salina al 0,9% seguido de paraformaldehído (PFA) al 4%. Después de la perfusión, los cerebros se diseccionaron y se fijaron en PFA al 4% durante la noche, seguido de ser embebidos en parafina y se hicieron en secciones seriadas de 5 µm. Después de la recuperación del antígeno por microondas en tampón de ácido cítrico a 95 ° C, los sitios inespecíficos fueron bloqueados con albúmina sérica bovina (ASC) al 5% durante 1 h a temperatura ambiente. A continuación, se incubaron las secciones cerebrales con 5 anticuerpos primarios hmC (1 : 1000, motivo activo, Estados Unidos, Cat. No., 39769) durante la noche a 4°C seguido de incubación con el anticuerpo secundario (1 : 200, Life Technology, Estados Unidos) 1 h a 37°C. se utilizó 4′,6-diamino-2-fenilindol (DAPI) para la tinción de inmunofluorescencia nuclear, y las imágenes de inmunofluorescencia se visualizaron y capturaron en un microscopio confocal (Leica sp5, Alemania).
2.14. Análisis estadístico
Todos los datos se expresaron como la media ± error estándar de la media (SEM) y se analizaron mediante SPSS., Se aplicó el análisis de varianza unidireccional (ANOVA) para determinar las diferencias entre los 3 grupos, seguido de la prueba t no paramétrica y la prueba de diferencia honestamente significativa de Tukey. el valor <0,05 fue considerado estadísticamente significativo.
3. Resultados
Tuina mejoró la pérdida de peso, la debilidad de la fuerza de las extremidades y los trastornos de los reflejos neurológicos inducidos por el HI.,
el peso corporal de las crías de rata se midió de P4 a P28, y se encontró que, de P22 a P28, el peso corporal de las ratas en el grupo Tuina (n = 11) aumentó significativamente en comparación con el grupo HI (n = 11; Figura 1(a)). Los resultados de la prueba del plano inclinado mostraron que los ángulos máximos fueron mayores en el grupo de Tuina que en el grupo de HI (Figura 1 (b)), lo que indicó una mejoría en la debilidad de la fuerza de las extremidades en el grupo de Tuina., Los resultados de los reflejos del sistema nervioso fueron los siguientes: en la prueba de reflejos de marcha, las crías de rata en el grupo HI comenzaron a alejarse del círculo con ambos miembros delanteros significativamente más tarde que los grupos control y Tuina (Figura 1(c)). En la prueba del reflejo de enderezamiento, las ratas del grupo Tuina tardaron menos tiempo en enderezarse que las del grupo HI de P7 a P11 (Figura 1(d)).
Tuina promovió las funciones de aprendizaje y memoria de las crías de rata hipóxico-isquémicas.,
Se realizó la prueba de laberinto de agua de Morris y la prueba de paso hacia abajo para evaluar las funciones de aprendizaje y memoria de las ratas. Como se muestra en la Figura 2 (a), las pistas de movimiento en el día del ensayo de sonda de la prueba MWM muestran que el número de cruces de ubicación de plataforma del grupo HI fue significativamente menor que el del grupo control y el grupo Tuina (Figura 2(b)). En la prueba de reducción, las ratas HI mostraron un tiempo de latencia significativamente menor y más errores en comparación con las ratas control y Tuina (Figuras 2(c) y 2(d)).
Tuina aumentó los niveles de 5 hmC y Tet2 en la corteza temporal cerebral de ratas HI.,
para examinar si el nivel de 5 hmC se vio afectado durante el desarrollo de PC, realizamos pruebas de dot blot y observamos que el nivel de 5 hmC de ratas HI disminuyó significativamente en comparación con el del control, mientras que este nivel se incrementó parcialmente después de Tuina (; Figura 3(a)). Mientras tanto, la tinción por inmunofluorescencia demostró que la fusión de 5 hmC y la tinción DAPI y HI condujo a una disminución de 5 hmC genómico en la corteza temporal izquierda, mientras que el tratamiento con Tuina restauró el nivel de 5 hmC en algún grado (Figura 3(b)), lo que estaba en consistencia con los resultados del secamiento de puntos., Además, como se muestra en las figuras 3(c) y 3 (D), el grupo HI mostró una disminución de la expresión de Tet1 y Tet2 en comparación con el grupo control, mientras que solo el Tet2 aumentó después del tratamiento con Tuina.
3.1. Alteración y distribución de 5 hmc en todo el genoma
para investigar la ubicación y distribución exacta de 5 hmc en todo el genoma, se llevó a cabo la inmunoprecipitación de ADN hidroximetilado (hMeDIP) seguida de secuenciación de próxima generación (hMeDIP-seq)., Las ratas, respectivamente, de los grupos Control (n = 3), HI (n = 3) y Tuina (n = 3) fueron sacrificadas en P31, y se extrajo ADN genómico de la corteza del lóbulo temporal izquierdo para hMeDIP-seq. El patrón de todo el genoma de 5 niveles de hmC se evaluó contando 5 lecturas mapeadas por hmC en cada contenedor de 10 kb de las muestras de los grupos control, Tuina e HI y luego se normalizó hasta la cobertura total de secuenciación . Como se muestra en las figuras 4(a)-4 (c), la distribución de las lecturas de 5 hmC en todo el genoma en los tres grupos fue diferente, y luego exploramos más a fondo las regiones génicas específicas en las que existen estas diferencias., La figura 4 (d) muestra las características superpuestas de densidad normalizada de 5 lecturas hmC con las características genómicas conocidas en cuerpos de genes definidos y CGI (Islas CpG) de acuerdo con la tabla UCSC para RGSC6.0/rn6. Además, como se muestra en la Figura 4 (e), también se estudiaron las distribuciones de 5 hmC en los cuerpos genéticos y 1 kb hacia arriba y hacia abajo de los cuerpos genéticos., Se puede observar en las figuras 4 (d) y 4(e) que el nivel de 5 hmC del grupo HI difiere de los del grupo control y del grupo Tuina en el extremo 5′ del cuerpo genómico, especialmente en los sitios de ±500 PA de los sitios de inicio transcripcional (TSS) y el CGI dentro de 500 PA de TSS.
3.2. Identificación y anotación de regiones diferencialmente Hidroximetiladas (DhMRs)
para identificar los loci específicos que exhiben perfiles hmC alterados de 5, se procedió a identificar y caracterizar las DhMRs específicas de todos los autosomas y cromosomas sexuales a través del genoma., Curiosamente, hubo una gran diferencia en la distribución de hiper-DhMRs e hipo-DhMRs en el cromosoma X (Figuras 5(A)-5(c)). Para explorar más a fondo la importancia biológica de los DhMRs encontrados, los genes asociados con estos DhMRs fueron extraídos para el análisis de enriquecimiento de la ontología génica (GO)., Como se muestra en las figuras 5 (d) y 5(e), el análisis de enriquecimiento de GO indicó que estas hipo-Dhmr en el grupo HI se encontraron altamente enriquecidas en las vías funcionales relacionadas con el neurodesarrollo y las funciones neuronales, incluido el crecimiento celular del desarrollo, la extensión de la proyección neuronal, la regulación positiva del crecimiento del desarrollo, el crecimiento del desarrollo involucrado en la morfogénesis y la diferenciación de las células gliales.,
basado en el análisis exhaustivo de las listas de genes diferenciales de hidroximetilación de los tres grupos, seleccionamos seis genes asociados hipo-DhMRs del grupo HI que estaban todos asociados con las funciones del sistema nervioso para investigar la relación entre las alteraciones 5 hmC y los niveles de transcripción de estos genes., Como era de esperar, se encontró que, de acuerdo con la modificación reducida de 5 hmC en Casd1, Prkg2 y Slc44a1, los niveles de ARNm correspondientes también disminuyeron significativamente en el grupo HI en comparación con los grupos control y Tuina (Figura 5(f)).
4. Discusión
con seguridad general y eficacia reputada, la medicina tradicional china (MTC) es fácilmente aceptada por la población general de todo el mundo. La MTC se ha aplicado ampliamente en diversas enfermedades pediátricas, como el sarcoma de Ewing , el asma , la enfermedad de Graves y los trastornos alérgicos pediátricos ., Mientras tanto, también hay estudios que indican que las terapias de MTC, como la Tuina, las hierbas medicinales y la acupuntura, son bien toleradas y tienen efectos terapéuticos positivos sobre la parálisis cerebral . Debido a los resultados clínicos prometedores y menos efectos secundarios, el masaje chino Tuina ha atraído un creciente interés en términos del tratamiento para la PC.
como una nueva modificación epigenética, 5 hmC no solo sirve como un intermediario de los procesos de desmetilación del ADN, sino que también actúa como un marcador epigenético estable durante el desarrollo de varias enfermedades ., 5 hmC está diez veces más enriquecido en neuronas que en otras células y su regulación dinámica es crítica en el neurodesarrollo postnatal . Además, la alteración del nivel global de 5 hmC se ha considerado estrechamente relacionada con muchos trastornos neurodegenerativos y enfermedades del neurodesarrollo .
sin embargo, hasta donde sabemos, pocos estudios se han centrado en la conexión entre la hidroximetilación del ADN y la parálisis cerebral, que se convirtió en la inspiración para nuestra investigación., En nuestro estudio, los resultados del DOT blotting y la inmunofluorescencia revelaron que el nivel global de 5 hmC en la corteza del lóbulo temporal cerebral disminuyó significativamente después de la lesión por HI, lo que es consistente con el nivel reducido de 5 hmC en el riñón de ratón después de la isquemia-reperfusión . Sin embargo, después del tratamiento con Tuina, 5 el nivel de hmC en el grupo de Tuina fue mayor que en el grupo de HI., Además, se sabe que la 5 hmC se produce a través de la oxidación de 5 mC por proteínas Tet, con base en la cual detectamos los niveles de proteínas Tet1 y Tet2 y encontramos que ambos niveles disminuyeron significativamente después de la lesión por HI, mientras que solo la proteína Tet2 aumentó después del tratamiento con Tuina. En total, estos hallazgos implican que la reducción de la expresión de Tet1 y Tet2 puede contribuir a la disminución de 5 hmC después de la lesión de HI y Tuina puede aumentar el nivel de 5 hmC a través de la mejora de la expresión de Tet2.,
por el contrario, la metilación CGI en promotores se encontró crítica en el silenciamiento de genes y 5 hmC puede jugar un papel en la expresión génica mediada por la desmetilación del ADN . En nuestro estudio, el grupo HI mostró una disminución del enriquecimiento de todo el genoma 5 hmC en CGI dentro de 500 bp de TSS en comparación con los grupos control y Tuina, mientras que Tuina aumentó la distribución de todo el genoma de 5 hmC., Mientras tanto , en línea con los hallazgos anteriores de que el enriquecimiento de 5 hmC en el cuerpo del gen puede tener una fuerte correlación con el aumento de la transcripción de los genes afectados en las neuronas, nuestros resultados de RT-PCR mostraron que el agotamiento de la modificación de 5 hmC en los genes Prkg2, Casd1 y Slc44a1 se acompañó de los niveles reducidos de ARNm de estos genes en el grupo HI., Con base en todos estos hallazgos mencionados anteriormente, se indicó que la modificación de la 5 hmC puede desempeñar un papel crítico en la patogénesis de la PC a través de la regulación de la transcripción y expresión de los genes relacionados con las funciones neuronales y que la Tuina puede producir efectos terapéuticos sobre la PC a través de la modulación de la 5 hmC.
más interesante, se encontró que la PC y los trastornos del desarrollo relacionados son más comunes en los pacientes masculinos y el modelo de ratón neonatal femenino de lesión cerebral HI también mostró una menor ocurrencia de PC específica del género , la razón de la cual todavía es incierta., Con el fin de evitar la interrupción de estos posibles efectos protectores específicos del género, solo se seleccionaron crías de rata macho para nuestro estudio. Notablemente, en el mapa circular de todo el genoma (Figura 5 (a)), se observaron grandes diferencias en la distribución de hiper-DhMRs e hipo-DhMRs en el cromosoma X a partir de la comparación entre dos grupos cualquiera en nuestro estudio, lo que confirma aún más la correlación entre el sexo y la aparición de parálisis cerebral., Notablemente, debido a las limitaciones de nuestro laboratorio, no pudimos hacer el control de IgG o generar las bibliotecas de entrada, y los Dhmr se identificaron comparando directamente uno con el otro en lugar de comparar con la entrada, lo que intentaremos mejorar en nuestros estudios futuros para hacer la investigación más precisa.
además, los análisis de GO de genes asociados a hypo-DhMRs en el grupo HI mostraron que estos genes están altamente enriquecidos en múltiples vías de señalización relacionadas con el neurodesarrollo y las funciones neuronales., En nuestro experimento, el retraso del crecimiento y los trastornos del neurodesarrollo aparecieron en el grupo de IH en forma de pérdida de peso, debilidad en la fuerza de las extremidades y varios trastornos del reflejo neuronal que se mejoraron con el tratamiento con Tuina hasta cierto punto. Además, a partir de los resultados de la prueba de laberinto de agua de Morris y la prueba de evitación de paso hacia abajo, Tuina mejoró significativamente las funciones de aprendizaje y memoria de ratas hipóxico-isquémicas., Estos resultados indican la correlación entre la alteración en los loci de 5-hidroximetilcitosina y el desarrollo neuronal y sugiere además que la terapia con Tuina puede influir en el desarrollo cerebral y las funciones cognitivas cerebrales a través de la modulación de la hidroximetilación del ADN.
en el presente estudio, proporcionamos mapas genómicos de 5 hmC de los grupos control, HI y Tuina y revelamos alteración en el estado de hidroximetilación del ADN y cambio dinámico de 5 hmC después del tratamiento con Tuina, lo que puede arrojar luz sobre el posible mecanismo terapéutico de Tuina para la PC.,
disponibilidad de los datos
los datos utilizados para apoyar los hallazgos de este estudio están disponibles a solicitud del autor correspondiente.
conflictos de intereses
los autores declaran que no existen conflictos de intereses.
las contribuciones de los autores
Yunpeng Zhang y Chao Gao contribuyeron igualmente a este trabajo.,
agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81774444), el proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología de la Provincia de Henan (182102310403), el proyecto de Investigación Clínica Cooperativa China-Canadá, el programa de estudios en el extranjero de la Provincia de Henan (201721) y el proyecto de Investigación de Ciencia y Tecnología Médica de la Provincia de Henan (proyecto de construcción Provincial y ministerial) (201701034).