ser capaz de diferenciar las especies bacterianas es importante por una serie de razones, desde el diagnóstico de la infección o la comprobación de la seguridad alimentaria, hasta la identificación de qué especie es la que le da a un queso su carácter fantástico. Las especies bacterianas, e incluso cepas específicas pueden ser diferenciadas utilizando una serie de técnicas moleculares como la PCR, la PCR cuantitativa, la secuenciación del genoma y la espectrometría de masas., Pero incluso sin entrar en el meollo molecular, hay diferencias fenotípicas entre grupos de bacterias que se pueden utilizar para diferenciarlos. Esto incluye características como su forma (bacilos vs Cocos, por ejemplo), crecimiento en nutrientes particulares y preferencia por ambientes altos o bajos de oxígeno. Dependiendo de la característica que se esté estudiando, las especies bacterianas pueden dividirse en grupos amplios, pero tomados en conjunto, esta información puede reducir las identidades posibles en gran medida., Una de estas clasificaciones útiles-si una bacteria es Gram positiva o Gram negativa – se basa en la estructura de las paredes celulares bacterianas.
diferencia en la estructura de bacterias Gram positivas vs bacterias Gram negativas
El siguiente diagrama ilustra las diferencias en la estructura de bacterias Gram positivas y Gram negativas. Las dos características clave que conducen a las diferentes propiedades de visualización de las especies Gram positivas y Gram negativas son el espesor de la capa de peptidoglicano y la presencia o ausencia de la membrana lipídica externa., Esto se debe a que la estructura de la pared afecta la capacidad de la célula para retener la mancha violeta de cristal utilizada en el procedimiento de tinción de Gram, que luego se puede visualizar bajo un microscopio de luz.
Las bacterias Gram positivas tienen una capa gruesa de peptidoglicano y ninguna membrana lipídica externa, mientras que las bacterias Gram negativas tienen una capa delgada de peptidoglicano y tienen una membrana lipídica externa.
como las bacterias Gram positivas carecen de una membrana lipídica externa, cuando se refieren correctamente a su estructura en lugar de las propiedades de tinción, se denominan monodermos., La membrana lipídica externa que poseen las bacterias gramnegativas significa que, al referirse a su estructura física, se denominan didermas.
La técnica de tinción de Gram fue desarrollada en 1884 por el bacteriólogo danés Hans Christian Gram1. Si bien una tinción de Gram no le dirá la especie específica que está mirando, puede ser una forma rápida de reducir en gran medida la lista de posibles candidatos y realizar pruebas de seguimiento directas cuando sea necesario.,
tinción Gram positiva vs Gram negativa
procedimiento de tinción de Gram-preparación de una muestra
1. Etiquete un portaobjetos de microscopio de vidrio limpio con la identificación de la muestra. Asegúrese de usar un lápiz, ya que los reactivos utilizados en el procedimiento de tinción eliminan muchas tintas.
2. Si prepara su portaobjetos a partir de un cultivo bacteriano líquido: aplique una pequeña gota de cultivo sobre el portaobjetos utilizando un bucle estéril. Frote suavemente la gotita con un movimiento circular en un área de aproximadamente 1 cm de diámetro., Para cultivos muy densos, puede ser necesario pre-diluir su cultivo para garantizar que las células bacterianas individuales puedan verse bajo un microscopio después de la tinción.
Si el material de origen es de una placa bacteriana:
resuspender un bucle de material de Colonia en solución salina tamponada de fosfato estéril (PBS) y luego proceder como para un cultivo líquido.3. Una vez que el frotis se haya secado al aire, pase el portaobjetos untado a través de una llama dos o tres veces.
esto mata los microbios en el frotis y fija la muestra a la diapositiva, tenga cuidado de no sobrecalentar la muestra sin embargo, ya que esto puede distorsionar la morfología celular.,
procedimiento de tinción de Gram-tinción de Gram a muestra
1. Inundar suavemente el frotis con cristal violeta y dejar actuar durante 1 minuto. Incline el portaobjetos ligeramente y enjuague suavemente con agua del grifo o agua destilada.violeta de cristal es un colorante soluble en agua que entra en la capa de peptidoglicano en la pared celular bacteriana.
2. Inunda suavemente el frotis con yodo de Gram y déjelo durante 1 minuto. Incline el portaobjetos ligeramente y enjuague suavemente con agua del grifo o agua destilada. La Mancha ahora aparecerá púrpura.,
solución de yodo de Gram (yodo y yoduro de potasio) se añade para formar un complejo con el cristal violeta, que es mucho más grande y es insoluble en agua.3. Decolorar el frotis usando alcohol etílico al 95 % o acetona. Incline la diapositiva ligeramente y aplique el alcohol gota a gota hasta que el alcohol funcione casi claro (5-10 segundos). Enjuague inmediatamente con agua para evitar una decoloración excesiva.el decolorante deshidrata la capa de peptidoglicano, encogiéndola y tensándola., En las bacterias Gram positivas, los grandes complejos cristalinos violeta-yodo son incapaces de penetrar y escapar de la gruesa capa de peptidoglicano, lo que resulta en células teñidas de color púrpura. Sin embargo, en las bacterias Gram negativas, la membrana externa se degrada, la fina capa de peptidoglicano es incapaz de retener los complejos cristalinos violeta-yodo y el color se pierde.
4. Suavemente inundación con safranina de contraste y se deja durante 45 segundos. Incline el portaobjetos ligeramente y enjuague suavemente con agua del grifo o agua destilada.,la safranina es débilmente soluble en agua y tiñe las células bacterianas con un rojo claro, lo que permite la visualización de las células Gram negativas sin interferir con la observación de la púrpura de las células Gram positivas.
5. Seque el portaobjetos en papel de filtro y luego vea el frotis usando un microscopio de luz bajo inmersión en aceite.
color Gram positivo vs Gram negativo
bacterias Gram positivas
Las bacterias Gram positivas tienen una apariencia púrpura distintiva cuando se observan bajo un microscopio de luz después de la tinción de Gram., Esto se debe a la retención de la mancha violeta de cristal púrpura en la gruesa capa de peptidoglicano de la pared celular. Ejemplos de bacterias Gram positivas incluyen todos los estafilococos, todos los estreptococos y algunas especies de listeria.
bacterias Gram negativas
Las bacterias Gram negativas aparecen de un color rojizo pálido cuando se observan bajo un microscopio de luz después de la tinción de Gram. Esto se debe a que la estructura de su pared celular es incapaz de retener la mancha violeta cristalina, por lo que son coloreados solo por la contra-tintura de safranina., Ejemplos de bacterias Gram negativas incluyen enterococos, especies de salmonella y especies de pseudomonas.
La tinción de Gram no se puede utilizar de forma fiable para evaluar las relaciones filogenéticas bacterianas. Se cree que la membrana única de las especies Gram positivas es el estado ancestral. Históricamente se había pensado que la segunda membrana encontrada en las bacterias Gram negativas evolucionó una sola vez, por lo que todas las especies Gram negativas estaban más estrechamente relacionadas entre sí que con las especies Gram positivas., Sin embargo, el análisis genético ha demostrado desde entonces que este no es el caso y es probable que haya evolucionado varias veces en diferentes linajes, un producto de la evolución convergente.