Tiivistelmä
lisäksi poikkeavuuksia moottorin ja ryhti, lapset, joilla on cp-vamma (CP) on usein kehitysvammaisia. Täydentävä ja vaihtoehtoinen perinteinen Kiinalainen lääketiede (TCM) hoito, Kiinalainen Tuina-hieronta, jota kutsutaan myös Tuina Kiinassa, on laajalti sovellettu kliininen hoito CP Kiinassa pitkään. Molekyyliperusta tälle on kuitenkin vielä pitkälti tuntematon., Viime aikoina DNA-hydroxymethylation on osoitettu olevan herkkiä ympäristössä ja näytelmiä kriittiset roolit jotkut neurologiset häiriöt, ottaa huomioon, että tutkimus keskittyy suhdetta 5 hmC ja Tuina-terapia cp-vamma on puutteellinen. Tutkimuksessa havaitsimme ensin, että Tuina paransi hypoksikemiallisten (HI) rotanpoikasten oppimista ja muistitoimintoja. Samaan aikaan, 5 hmC tasolla, ohimolohkon kuorikerroksen HI vastasyntyneiden rotta malli on vähentynyt merkittävästi verrattuna rottien valvonta-ja Tuina ryhmiä., Sitten käytimme Hmedip-Seq-menetelmää selvittääksemme, onko DNA-hydroksimetylaatio mukana tuina-terapiassa CP-vammalle. Genomista kommentointi DhMRs HI-konsernin hypo-hydroxymethylation geenejä paljasti rikastamiseen useita hermoston signalointireitteihin. Lisäksi huomasimme, ehtyminen 5 hmC muutoksia geeneissä, jotka liittyvät hermoston kehitykseen oli mukana vähentää mRNA tasot näistä geeneistä., Yhdessä meidän tulokset osoittavat, että Tuina voi säädellä ilmaus hermoston liittyviä geenejä muuttamalla tilan DNA hydroxymethylation, mikä parantaa oppimista ja muistia toiminnot cp-vamma.
1. Johdanto
Cp-vamma tapahtuu aikana perinataalisten on merkittävä syy varten hankittu vamma., Esiintyminen cp-vamma lapsilla korreloi useita tekijöitä, kuten hypoksia-iskemia, infektio, oksidatiivinen stressi-ja tulehdusreaktio, joista hypoksia-iskemia (HEI) voi aiheuttaa cp-vamma (CP) laukaisemalla perinataalisen aivojen vaurioita keskosilla . CP on yleisin vastasyntyneen krooninen vamma, jolle on ominaista moottorin ja ryhdin häiriöt, ja on usein mukana kognitiiviset ja oppimisen alijäämät . Perustiedot tieteestä tutkimukset, HI vastasyntyneiden rotta malli on laajalti käytetty tutkia käyttäytymiseen tuloksia ja patogeneesi cp-vamma ., Vaikka suuri edistysaskel CP tutkimukset, molekyylitason mekanismeja, miten hypoksia-iskemia edistää CP kehityksen ja etenemisen silti jäädä epäselväksi.
tänä päivänä, nykyisen hoitomuotojen CP sisältää lähinnä ortopedinen leikkaus, antispasticity lääkkeitä, ja erilaisia motorisen oppimisen interventioita , joista useimmat toimivat vain hoitoon komplikaatioita, jotka liittyvät CP ja voi aiheuttaa haittavaikutuksia., Kuitenkin perinteinen Kiinalainen lääketiede (TCM), mukaan lukien Tuina, akupunktio ja kasviperäisten lääkeaineiden, yksin tai yhdistettynä tavanomaiseen hoitoon, länsi-lääke, on laajalti käytetty vaihtoehtoinen hoito CP Kiinassa . Tuina on ikivanha muoto lääketieteen hieronta Kiinalainen lääketiede, jossa käytetään sormen paine acupoints, jotka ovat putatively herkistynyt, jonka elinten vajaatoiminta . Erityisesti, Tuina, turvallisempi ja tehokkaampi interventio, on näkyvissä selviä vaikutuksia cp-vamma kliinisessä käytännössä. Tarkkaa mekanismia siitä, miten Tuina vaikuttaa CP: hen, ei ole kuitenkaan vielä selvitetty.,
päinvastoin, pathogenically, ympäristö-herkkä epigeneettiset muutokset ovat jo osoittautuneet olla mukana neurogenesis , oppiminen ja muisti , ja synaptic plastisuus . Eri epigeneettisiä muutoksia, DNA metylaatio viidennen hiilen tymiini (5-methylcytosine, 5 mC) on laajimmin tutkittu epigeneettinen muutos, joka pelaa tärkeä rooli kromatiinin rakenne remolding, transkription tukahduttaminen, ja solujen erilaistumista ., Lisäksi hapettumista 5 mC 5-hydroxymethylcytosine (5 hmC) kymmenen-yksitoista translokaatio (TET) geeni perhe on ehdotettu uusi mekanismi poistaminen 5 mC , ja 5 hmC on ehdotettu olevan kriittinen huolto hermosolun rakenne ja toiminnot, koska sen ilmeinen rikastamiseen aivoissa . Samaan aikaan, 5 hmC muutos on myös havaittu monissa tutkimuksissa olevan yhteydessä neurologiset häiriöt, kuten Alzheimerin tauti , Rettin oireyhtymä , fragile-X-associated tremor/ataxia syndrome , Huntingtonin tauti , ja autismin kirjon häiriöt ., Näiden todisteiden perusteella laadittiin hypoteesi, että 5 hmC muutoksia voi pelata kriittinen rooli hermoston sairaus.,
tutkia läsnäolo osallistuminen Tuina-hoito muutos 5 hmC CP, haimme vakiintunut kemiallisia merkintöjä ja affiniteetti puhdistus menetelmä yhdistettynä korkea suoritusteho sekvensointi teknologia paljastaa mahdollista genome-wide 5 hmC muutoksia HI rotat ennen ja jälkeen Tuina-hoito voidaan etsiä suhdetta 5 hmC ja Tuina terapeuttisia vaikutuksia CP, jolloin saadaan todisteita tukemaan soveltaminen Tuina-terapia cp-vamma.
2. Materiaalit ja menetelmät
2.1., Eläinten Malli
Kaikki kokeet oli hyväksynyt Eettinen Komitea, Eläinten Hoito Jinshanin Sairaala sidoksissa Fudanin Yliopistossa. Aiemmin kuvatulla tavalla käytettiin muunneltua Rice–Vannucci-mallia . Vastasyntyneiden HI malli tehtiin Sprague-Dawley-uros rotta pups (Slac-Laboratorion Eläinten Yritys, Shanghai, Kiina) on synnytyksen jälkeinen päivä 3 (P3) kautta ligaatio jätti yhteisen kaulavaltimon alle 3% isofluraani anestesian. Jokaisen rotan leikkausaika saatiin kuriin 10 minuutissa., Talteenoton jälkeen 1 tunti, nämä pennut olivat sijoitettu hypoksia jaosto 37°C, ja edellyttäen, että kaasun sekoitin koostuu 8% O2 ja 98% N2 3,5 tuntia. Sham eläimiä oli sama operaatio paljastaa yhteisen kaulavaltimon ilman sitomiseen ja hypoksia. Leikkauksen jälkeen rotanpoikaset palautettiin kotihäkkiinsä.
2, 2. Tuina-Hoito
Tuina-hoito suoritettiin erikoistunut tutkija ammatillinen lääkärin todistus. Päivä P4 että P31, rotta pups in Tuina ryhmä hyväksyi Tuina interventio, joka suoritetaan 120 kertaa/min 15 minuutin ajan, kerran päivässä.,f Tuina on seuraava: ensin, rotta oli sijoitettu palm manipulaattori on vasen käsi sopeutua ympäristöön; toiseksi, manipulaattori käyttää keskisormi hänen oikea käsi varovasti hieroa rotan kaulasta hännän kolme kertaa rentoutua sen lihaksia; kolmanneksi, Tuina toteutettiin peräkkäisillä hankaus, vaivaamista, ja yhden sormen työntää selkärankaa pitkin rotat ylhäältä alas ja sisältä ulos dorsum ja ambilateral nivelsiteitä sekä lihaksia pitkin du meridian ja virtsarakon meridian rat viitaten liittyvät perinteinen Kiinalainen lääketiede (TCM) toimii.,
2, 3. Vastasyntyneiden rottien oikaisurefleksiä
arvioitiin P5: stä P11: een, kuten edellä on kuvattu . Tämän testin aikana, rotta pups pantiin selälleen puhdistaa tasainen pinta ja aika nämä pennut reachieve vatsallaan, jossa kaikki neljä tassut oli mitattu.
2, 4. Kävely Refleksi
Rotta pennut olivat sijoitettu keskelle valkoinen pyöristetty pahvi (13 cm halkaisijaltaan), ja päivä, kun he muuttivat pois ympyrän sekä forelimbs oli kirjattu .
2, 5., Kalteva taso Testi
Tämä testi oli tapana mitata raajan voimaa kirjaamalla maksimaalinen kulma rinteen päälle, jossa rotan poikasilla voi vielä hallita pitoa päivänä P21, kuten Kuvassa 1(b) . Tämän testin aikana rotat olivat sijoitettu päin oikealle tai vasemmalle ja kulma kone oli kasvanut 5° viiden sekunnin välein, jotta voidaan määrittää suurin kulma rinne, jonka rotta voisi silti pitää .
2, 6. Step-Down Välttämistesti
Tämä testi toteutettiin muistin säilyttämisen mittaamiseksi . Rotta laitettiin varovasti lieriömäiselle eristyslavalle (4.,5 cm halkaisijaltaan ja korkeus) ilmastointi jaosto sopeutua ympäristöön 3 min. Kun rotta astuu alas laiturilta, se sähköistyy välittömästi. 5 minuutin harjoituksessa (P26) rotat koulutettiin hyppäämään takaisin lavalle sähköstimulaation välttämiseksi. Testi-istunnot (24 h koulutuksen jälkeen, eli, P27), latenssi aika (aika rotat astua alas lavalta ensimmäistä kertaa) ja virheiden määrä (taajuus rotat astua alas lavalta) kirjattiin.
2, 7., Morris Vesi Maze (MWM) Testi
jotta voitaisiin arvioida paikkatietojen oppimisen ja muistin, Morris vesi maze testi tehtiin 5 päivää, kuten aiemmin on kuvattu . Vesi labyrintti (Shanghai Xinyuan tietotekniikan Yritys, Shanghai, Kiina) oli jaettu neljään neljännestä, ja alustan (5 cm halkaisijaltaan) oli sijoitettu 1 cm veden pinnan alle yhden kvadrantin. Koulutustilaisuuksia (P27–P30), kaikki rotat olivat koulutettu neljä kertaa päivässä neljän peräkkäisen päivän ajan, ja he saivat löytää piilotettu alustan sisällä 60 s., Jos rotta ei löytänyt alustan sisällä 60 s, se oli kevyesti ohjataan alustan ja saa pysyä siinä 30 s ennen kuin ne lähetetään takaisin häkkiin. Päivänä, jotta alueellinen koetin tutkimuksessa (P31) foorumi poistettiin ja rotat päästettiin vettä edessään allas seinään, samaan asentoon kuin koulutustilaisuuksia. Tämän jälkeen kirjattiin liikeradat ja laiturin sijaintiristeysten määrä.
2, 8., Pisteblottauksella
valmistumisen Jälkeen edellä mainitut testit, rotta pennut olivat uhrata P31 ja niiden aivot olivat dissektoitujen kerätä koko DNA vasemmalle ajallinen cortex, jonka QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Saksa). 2,5 µL genomista DNA: ta (100 ng/µL) nähtiin nylon kalvot seuraa paistaminen lämpötilassa 80°C: ssa 30 min cross-link DNA: ta . Jälkeen estää 5% rasvatonta maitoa 1 h huoneenlämmössä, kalvoa inkuboitiin kanssa polyklonaalisia 5 hmC-aine (1 : 1000 laimennosta, Aktiivinen Aihe, yhdysvallat, Kissa. Ei., 39769) 4°C: ssa yön yli ja piparjuuriperoksidaasi (HRP)-konjugoitua sekundaarista vasta-ainetta käytettiin seuraavana päivänä. Dot blot-kalvo värjättiin 0,02% metyleenisinisellä (MB) yhtäläisen kuormituksen varmistamiseksi.
2, 9. Hydroxymethylated DNA Immunoprecipitation (hMeDIP) Analyysi-ja Korkea Suoritusteho Sekvensointi
Genomista DNA: ta oli poimittu vasemmalle ajallinen cortex rotta pups (valvonta -: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) ja sonikoitiin että 200-350 emäsparia (bp). DNA-sirpaleet korjattiin loppuun, A-pyrstö-ja Illumina-sovittimet sidottiin., Sitten adapterin sitoma DNA denaturoitiin ja inkuboitiin 5 hmC-vasta-aineella (Active Motif, Yhdysvallat, Cat. Nro 39769) 4°C: ssa yön yli. Vasta-aine-DNA-kompleksit saatiin talteen proteiini A/G: n helmillä. Immunoprecipated DNA puhdistettiin ja tehtiin korkean suoritustehon sekvensointi suoritetaan Illumina HiSeq3000 järjestelmä (Illumina, Yhdysvallat) .
2, 10. Sekvensointitietojen ja bioinformatiikan kartoitus
sekvensointitietojen käsittely suoritettiin aiemmin kuvatulla tavalla . Fastq-sekvenssitiedostot biologisten päällekkäisyyksien jälkeen yhdenmukaistettiin UCSC rat reference genomiin (RGSC6.0/rn6) ., Ainutlaatuinen, nonduplicate lukee käytettiin huippu soittaa ja merkintä, jonka hypergeometrinen optimointi motiivi rikastamiseen (HOMER) . 5-HMC rikastushuiput määritettiin ChIP-Seq (MACS)-ohjelmiston mallipohjaisella analyysillä . Ja differentiaalisesti hydroxymethylated alueilla (DhMRs) todettiin kaikkien paria 5-hmC-rikastettua näytettä suoraan vertaamalla yksi näyte, jossa toinen joka suuntaan . Gene ontology (GO) – analyysit tehtiin Daavidin avulla .
2, 11. Kvantitatiivinen RT-PCR
kokonais-RNA uutettiin vasemmasta ohimolohkon aivokuoresta., CDNA: n käänteinen transkriptio suoritettiin käyttäen PrimeScript RT Master Mix-sarjaa (Takara, Japani). Kvantitatiiviset RT-PCR-reaktiot suoritettiin 7500 reaaliaikaisella PCR-järjestelmällä (Applied Biosystems, Yhdysvallat) käyttäen SYBR Greeniä (Takara, Japani). β-aktiinia käytettiin sisäisenä kontrollina, ja kohdegeenin suhteellinen ilmentyminen määritettiin 2−ΔΔCT-menetelmällä., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting-Määritys
eristetty vasemmalle ajallinen koru aivokuori lisättiin jääkylmää proteiinia lysate ja sentrifugoidaan 12000 r/min, 20 min, 4°C. Proteiinia näytteet olivat erotettu elektroforeesi käyttäen SDS-PAGE ja siirrettiin PVDF-kalvoja (Milliporen, yhdysvallat). Jälkeen estää 5% rasvatonta maitoa 2 h huoneenlämmössä, limakalvot olivat inkuboitiin kanssa ensisijainen vasta-aineita 4°C yön yli ja sitten inkuboitiin kanssa HRP-konjugoitu sekundaarinen IgG-vasta-aineita. Ensisijaisia vasta-aineita tässä olivat anti-Tet1 (1: 1000, Abcam, UK, Cat. Ei., 191698), Anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, Yhdysvallat, Kat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1 : 1000, Abcam, iso-BRITANNIA, Kissa. Nro 110767), ja anti-β-proteiinista (1 : 2000, Cell Signaling Technology, yhdysvallat, Kissa. #2128). Kalvot olivat sitten kehitetty käyttäen ECL havaitseminen, ja signaalit olivat havaita Tanon-5200 Kemiluminesenssi Imaging System (Tanon, Shanghai, Kiina). Proteiinitasot analysoitiin Image J Softwarella (NIH, Bethesda, USA) ja normalisoitiin vastaavalle β-tubuliinitasolle.
2, 13., Immunofluoresenssi Confocal Mikroskopia
Rotta pennut olivat uhrata P31, ja heidän sydämensä olivat perfuusio 0,9% suolaliuosta, jota seuraa 4% paraformaldehydi (PFA). Kun perfuusio, aivot leikattiin ja kiinnitettiin 4% PFA yön jälkeen on upotettu parafiini ja valmistetaan 5 µm serial kohdat. Kun mikroaaltouuni antigen retrieval in sitruunahappo puskuri 95°C, epäspesifinen sivustoja blokattiin 5% naudan seerumin albumiini (BSA) 1 h huoneenlämmössä. Seuraavaksi aivojen osia inkuboitiin 5 HMC primaarisella vasta-aineella (1: 1000, Active Motif, Yhdysvallat, Cat. Ei., 39769) yön yli 4°C, jonka jälkeen inkubaation toissijainen vasta-aine (1 : 200, Elämä, Teknologia, yhdysvallat), 1 h 37°C. 4′,6-diamino-2-phenylindole (DAPI) käytettiin ydinaseiden immunofluoresenssi värjäystä, ja immunofluoresenssi kuvat olivat visualisoidaan ja kiinni confocal mikroskoopilla (Leica sp5, Saksa).
2, 14. Tilastoanalyysi
kaikki tiedot ilmaistiin keskiarvon (SEM) ± keskivirheenä ja analysoitiin SPSS: n avulla., Yksisuuntainen varianssianalyysi (ANOVA) on sovellettu määrittää eroja 3 ryhmää, jonka jälkeen parametrinen t-testi ja Tukey oikeasti merkittävä ero testi. arvoa <0, 05 pidettiin tilastollisesti merkitsevänä.
3. Tulokset
Tuina paranivat painon laskua, raajan voimakkuuden heikkoutta ja HI: n aiheuttamien neurologisten refleksien häiriöitä.,
paino rotan poikasilla oli mitattuna P4-P28, ja todettiin, että P22-P28, kehon paino rottia Tuina-ryhmä (n = 11) kasvoi merkittävästi verrattuna HI-ryhmä (n = 11; Kuva 1(a)). Tulokset kalteva taso testi osoitti, että suurin kulmat olivat korkeammat Tuina ryhmä kuin ne, HI-ryhmän (Kuva 1(b)), joka osoitti parannusta heikkous raajojen vahvuus Tuina-ryhmä., Tulokset hermoston refleksit olivat seuraavat: kävelyä refleksit testi, rotta pups HI-ryhmä alkoi siirtyä pois ympyrän sekä forelimbs huomattavasti myöhemmin kuin ne, hallita ja Tuina ryhmät (Kuva 1(c)). Vuonna oikaisevan refleksi testi, rottia Tuina ryhmä otti lyhyempi aika oikeassa, itse kuin ne, HI-ryhmä P7, jotta P11 (Kuva 1(d)).
Tuina edisti hypoksikemiallisten rotanpoikasten oppimista ja muistitoimintoja.,
Morris water maze-testi ja step-down-testi tehtiin rottien oppimis-ja muistitoimintojen arvioimiseksi. Kuten Kuvassa 2(a), liike kappaleita koetin oikeudenkäyntiä päivä MWM-testi osoittaa, että määrä alustan sijainti crossings HI-ryhmässä oli merkittävästi vähemmän kuin kontrolliryhmässä ja Tuina-ryhmän (Kuva 2(b)). Step-down test, HI rotilla oli merkittävästi lyhyempi latenssiaika ja enemmän virheitä verrattuna control ja Tuina rotilla (Luvut 2(c) ja 2(d)).
Tuina kasvoi 5 hmC ja Tet2 tasoa aivojen ajallinen cortex HI rotat.,
tutkia, onko taso 5 hmC vaikutti aikana CP kehitys, me suoriteta dot blot testit ja totesi, että 5 hmC tasolla HI rotat väheni merkittävästi verrattuna valvontaa, vaikka tämä taso oli osittain lisääntynyt sen jälkeen, kun Tuina (; Kuva 3(a)). Samaan aikaan, immunofluoresenssi-värjäys osoitti yhdistäminen 5 hmC ja DAPI värjäyksessä ja HEI johti lasku genomin 5 hmC vasemmalle ajallinen cortex, kun Tuina-hoito palauttaa 5 hmC tasolla jossain määrin (Kuva 3(b)), joka oli johdonmukaisuus tulokset pisteblottauksella., Lisäksi, kuten on esitetty kuvissa 3(c) ja 3(d), HI-ryhmä näkyy laski Tet1 ja Tet2 ilme verrattuna kontrolliryhmään, kun taas vain Tet2 oli lisääntynyt sen jälkeen, kun Tuina-hoito.
3.1. Genome-Wide 5 hmc Muuttaminen ja Jakelu
tutkia tarkka sijainti ja jakelu genome-wide 5 hmc, hydroxymethylated DNA immunoprecipitation (hMeDIP), jonka jälkeen seuraavan sukupolven sekvensointi (hMeDIP-seq) on suoritettu., Rotat, vastaavasti, Ohjaus (n = 3), HI (n = 3), ja Tuina (n = 3) ryhmät olivat uhrata P31, ja genomista DNA: ta vasemmalle ajallinen koru aivokuori oli uutettu varten hMeDIP-seq. Genome-wide kuvio 5 hmC taso arvioitiin laskemalla 5 hmC-kartoitettu lukee joka 10 kb bin näytteistä ohjaus, Tuina, ja HI-ryhmät ja sitten normalisoitu yhteensä sekvensointi kattavuus . Kuten on esitetty kuvissa 4(a)-4(c), jakelu genome-wide 5 hmC lukee kolme ryhmää oli erilainen, ja sitten me tutkia tietyn geenin alueilla, joilla näitä eroja., Kuva 4(d) osoittaa päällekkäisiä ominaisuuksia normalisoitu tiheys 5 hmC lukee tunnetaan genomista ominaisuudet määritellään geenin elinten ja CGI (CpG-saaret) mukaan UCSC taulukko RGSC6.0/rn6. Lisäksi, kuten Kuvassa 4(e), jakaumat 5 hmC klo geeni elinten ja 1 kb ylös – ja loppupään geenin elimet olivat myös tutkittu., Se voi olla havaittu alkaen Luvut 4(d) 4(e), että 5 hmC tasolla HI-ryhmän poikkesivat kontrolliryhmän ja Tuina ryhmä 5′ pää genomista kehon, erityisesti klo sivustoja ±500 bp transkription alku-sivustoja (TSS) ja CGI alle 500 bp TSS.
3, 2. Tunnistaminen ja Merkintä siitä Differentiaalisesti Hydroxymethylated Alueilla (DhMRs)
paikantaa erityisiä loci esillä muuttanut 5 hmC profiilit, me eteni tunnistaa ja kuvata konkreettisia DhMRs kaikki autosomes ja sukupuoli kromosomit koko genomin., Mielenkiintoista, siellä oli suuri ero jakelu hyper-DhMRs ja hypo-DhMRs X-kromosomissa (Luvut 5(a)-5(c)). Edelleen tutkia biologinen merkitys löytynyt DhMRs, geenejä, jotka liittyvät näiden DhMRs poimittiin gene ontologia (MENNÄ) rikastus-analyysi., Kuten kuvissa 5(d) ja 5(e), MENNÄ rikastamiseen analyysi osoitti, että nämä hypo-DhMRs HI-ryhmässä havaittiin erittäin rikastettu toiminnalliset polut, jotka liittyvät hermoston ja hermosolujen toimintoja, kuten kehityshäiriöitä solujen kasvua, neuroni projektio tiedostotunnistetta, positiivinen asetuksen kehityshäiriöitä kasvun, kehityksen kasvun mukana morfogeneesin parissa, ja glial solujen erilaistumista.,
Perustuu kattavan analyysin hydroxymethylation ero geenien luetteloita kolmeen ryhmään, me valinnut kuusi hypo-DhMRs liittyvät geenit HI-ryhmä, jotka kaikki liittyvät toiminnot hermoston välisen suhteen tutkimiseksi 5 hmC muutoksia ja transkription tasot näistä geeneistä., Kuten mitä on odotettavissa, todettiin, että mukaisesti vähennetty 5 hmC muutos Casd1, Prkg2, ja Slc44a1, vastaava mRNA-tasot olivat myös pienentyneet merkittävästi HI-ryhmässä verrattuna niihin, hallita ja Tuina ryhmät (Kuva 5(f)).
4. Keskustelu
yleisestä turvallisuudesta ja maineikkaasta tehosta, perinteinen kiinalainen lääketiede (TCM) on yleisesti hyväksytty kaikkialla maailmassa. TCM on sovellettu laajasti eri lasten sairauksiin, kuten Ewingin sarkooma , astma , Gravesin tauti , ja lasten allergisia sairauksia ., Samaan aikaan on myös tutkimuksia, joiden mukaan TCM-hoidot, kuten Tuina, kasviperäiset lääkkeet ja akupunktio, ovat hyvin siedettyjä ja niillä on positiivisia terapeuttisia vaikutuksia CP-vammoihin . Koska lupaavia kliinisiä tuloksia ja vähemmän sivuvaikutuksia, Kiinalainen Tuina-hieronta on herättänyt kasvavaa kiinnostusta kannalta hoito CP.
uutena epigeneettinen muutos, 5 hmC ei vain toimii väli-DNA-demetylaatio prosesseja, mutta toimii myös vakaa epigeneettiset merkki kehityksen aikana erilaisia sairauksia ., 5 hmC on neuroneissa noin kymmenkertainen muihin soluihin verrattuna, ja sen dynaaminen säätely on kriittistä syntymän jälkeisessä neurakehityksessä . Lisäksi muutos global 5 hmC taso on ollut läheisesti monet hermoston häiriöt ja hermoston sairauksia .
Kuitenkin, parhaan tietomme, harvat tutkimukset ovat keskittyneet yhteys DNA hydroxymethylation ja cp-vamma, josta tuli inspiraation meidän tutkimus., Tutkimuksessamme tulokset pisteblottauksella ja immunofluoresenssi paljasti, että global 5 hmC tasolla aivojen otsalohkon aivokuori oli merkittävästi vähentynyt sen jälkeen, kun HI vahinkoa, joka on sopusoinnussa vähentää 5 hmC tasolla hiiren munuainen jälkeen iskemia-reperfusion . Tuina-hoidon jälkeen 5 hmC: n taso Tuina-ryhmässä oli kuitenkin korkeampi kuin HI-ryhmässä., Lisäksi tiedetään, että 5 hmC tuotetaan hapettamalla 5 mC tet-proteiineilla, joiden perusteella havaitsimme Tet1-ja Tet2-proteiinien pitoisuudet ja todettiin, että molemmat tasot laskivat merkittävästi HI-vamman jälkeen, kun taas vain Tet2-proteiinia lisättiin Tuina-hoidon jälkeen. Kaikki nämä havainnot merkitsevät sitä, että vähentää Tet1 ja Tet2 ilmaisu voi edistää lasku 5 hmC jälkeen HI vahinkoa ja Tuina voi lisätä 5 hmC tason kautta parantaa Tet2 ilme.,
päinvastoin, CGI vaikka vetäjät löytyi kriittinen geenin hiljentäminen ja 5 hmC voi olla rooli geenin välittämä DNA-demetylaation kautta . Tutkimuksessamme, HI-ryhmä näkyy laski rikastuminen genome-wide 5 hmC CGI alle 500 bp TSS verrattuna control ja Tuina ryhmiä, kun taas Tuina lisääntynyt genomin laajuinen jakelu 5 hmC., Samaan aikaan, mukaisesti aiempia havaintoja siitä, että rikastuminen 5 hmC geenit laitos voi on vahva korrelaatio lisääntynyt transkriptio kyseisten geenien neuronien , meidän RT-PCR-tulokset osoittivat, että ehtyminen 5 hmC muutos Prkg2, Casd1, ja Slc44a1 geeni oli mukana vähentää mRNA tasot näiden geenien HI-ryhmä., Perustuu kaikki nämä havainnot edellä on mainittu, se oli ilmoittanut, että 5 hmC muuttaminen voi pelata kriittinen osa synnyssä CP sääntelyllä transkriptio ja ilmaus geenejä, jotka liittyvät hermoston toiminnot ja Tuina voi tuottaa terapeuttisia vaikutuksia CP kautta moduloiva 5 hmC.
Lisää kiinnostavaa, todettiin, että CP ja niihin liittyvät kehitykselliset häiriöt ovat yleisempiä nähnyt miehillä ja naisten vastasyntyneiden hiiri malli HI aivovamma näytetään myös sukupuoleen pienempi esiintyminen CP , syy, joka on vielä epävarmaa., Jotta voidaan välttää häiriöitä tämä on mahdollista tasa-erityisiä suojaavia vaikutuksia, vain uros rotta pups valittiin tutkimukseen. Merkillistä, genome-wide pyöreä kartta (Kuva 5(a)), on suuria eroja jakelu hyper-DhMRs ja hypo-DhMRs X-kromosomissa oli havaita, että vertailu välillä kaksi ryhmää tutkimuksessamme, mikä edelleen vahvistaa korrelaatiota sukupuolen ja esiintyminen cp-vamma., Erityisesti rajoituksista johtuen meidän lab, emme voineet tehdä IgG-ohjaus tai tuottaa input-kirjastot, ja DhMRs tunnistettiin suoraan verrata toisiinsa sen sijaan verrattaessa tulo, jota me aikovat parantaa meidän tulevissa tutkimuksissa, jotta tutkimusta tarkempi.
Lisäksi MENNÄ analyysit hypo-DhMRs-liittyvät geenit HI-ryhmä osoitti, että nämä geenit ovat erittäin rikastettu useita signalointi polkuja, jotka liittyvät hermoston ja hermosolujen toimintoja., Meidän kokeessa, kasvun hidastumista ja hermoston häiriöt ilmestyi HI-ryhmän muodossa laihtuminen, heikkous, raajojen vahvuus, ja useita hermoston refleksi häiriöt, jotka olivat parani Tuina-hoito jossain määrin. Lisäksi tuloksista Morris vesi maze testi-ja step-down välttäminen testi, Tuina parantaa oppimista ja muistia toimintoja hypoksinen-iskeeminen rotilla merkittävästi., Nämä tulokset osoittavat, että korrelaatio muutos 5-hydroxymethylcytosine loci ja hermoston kehitykseen ja furtherly viittaa siihen, että Tuina-hoito voi vaikuttaa aivojen kehitykseen ja aivojen kognitiivisia toimintoja kautta moduloiva DNA hydroxymethylation.
Tässä tutkimuksessa olemme toimittaneet genome-wide 5 hmC kartat ohjaus, HEI, ja Tuina ryhmien ja paljasti muutos DNA hydroxymethylation tila-ja 5-hmC dynaamisen muutoksen jälkeen Tuina-hoitoa, joka voi valottaa mahdollisia terapeuttinen mekanismi Tuina for CP.,
Tietojen Saatavuus
tietoja käytetään tukemaan tämän tutkimuksen tulokset ovat saatavilla vastaava kirjoittaja pyynnöstä.
eturistiriidat
kirjoittajat ilmoittavat, ettei eturistiriitoja ole.
kirjailijoiden osuudet
Yunpeng Zhang ja Chao Gao osallistuivat yhtä lailla tähän työhön.,
Kiitokset
Tämän työn tukivat National Natural Science Foundation of China (81774444), Henan Maakunnassa Tiede ja Technology Research Project (182102310403), Kiina-Kanada Osuuskunta Kliinisen tutkimushankkeen, Henan Maakunnassa Opiskella Ulkomailla Ohjelman (201721), ja Henan Maakunnassa Lääketieteen ja-Teknologian Tutkimus-Projekti (Maakunnan ja Ministeriön Rakentaminen-Hanke) (201701034).