être capable de différencier les espèces bactériennes est important pour une foule de raisons, du diagnostic de l’infection ou de la vérification de la sécurité alimentaire, à l’identification de l’espèce qui donne à un fromage son caractère fantastique. Les espèces bactériennes, et même des souches spécifiques peuvent être différenciées en utilisant un certain nombre de techniques moléculaires telles que la PCR, la PCR quantitative, le séquençage du génome et la spectrométrie de masse., Mais même sans entrer dans le grain moléculaire, il existe des différences phénotypiques entre les groupes de bactéries qui peuvent être utilisées pour les différencier. Cela inclut des caractéristiques comme leur forme (bacilles vs cocci par exemple), la croissance en nutriments particuliers et la préférence pour les environnements riches ou pauvres en oxygène. Selon la caractéristique étudiée, les espèces bactériennes peuvent être divisées en grands groupes, mais prises ensemble, ces informations peuvent réduire considérablement les identités possibles., Une telle classification utile – si une bactérie est Gram positive ou Gram négative – est basée sur la structure des parois cellulaires bactériennes.
différence de structure des bactéries Gram positives par rapport aux bactéries Gram négatives
Le diagramme ci-dessous illustre les différences de structure des bactéries Gram positives et Gram négatives. Les deux principales caractéristiques qui conduisent aux propriétés de visualisation différentes des espèces Gram positives et Gram négatives sont l’épaisseur de la couche de peptidoglycane et la présence ou l’absence de la membrane lipidique externe., En effet, la structure de la paroi affecte la capacité de la cellule à retenir la tache violette cristalline utilisée dans la procédure de coloration Gram qui peut ensuite être visualisée au microscope optique.
les bactéries à Gram positif ont une épaisse couche de peptidoglycane et aucune membrane lipidique externe tandis que les bactéries à Gram négatif ont une fine couche de peptidoglycane et ont une membrane lipidique externe.
comme les bactéries à Gram positif n’ont pas de membrane lipidique externe, lorsqu’elles se réfèrent correctement à leur structure plutôt qu’à leurs propriétés de coloration, on appelle monodermes., La membrane lipidique externe possédée par les bactéries Gram négatives signifie que, en se référant à leur structure physique, elles sont appelées didermes.
La technique de coloration de Gram a été développée en 1884 par le bactériologiste danois Hans Christian Gram1. Bien qu’une tache de gramme ne vous indique pas l’espèce spécifique que vous regardez, elle peut être un moyen rapide de réduire considérablement la liste des candidats potentiels et de procéder à des tests de suivi directs si nécessaire.,
à Gram positif vs Gram négatif tache
coloration de Gram la procédure de Préparation d’un échantillon
1. Étiquetez une lame de microscope en verre propre avec l’identification de votre échantillon. Assurez-vous d’utiliser un crayon car de nombreuses encres sont éliminées par les réactifs utilisés dans la procédure de coloration.
2. Si vous préparez votre lame à partir d’une culture bactérienne liquide:
tamponnez une petite culture de goutte sur la lame à l’aide d’une boucle stérile. Frottez doucement la gouttelette dans un mouvement circulaire dans une zone d’environ 1 cm de diamètre., Pour les cultures très denses, il peut être nécessaire de pré-diluer votre culture pour s’assurer que les cellules bactériennes individuelles peuvent être vues au microscope après la coloration.
Si le matériau d’origine provient d’une plaque bactérienne:
remettre en suspension une boucle de matériau de colonie dans une solution saline tamponnée au phosphate stérile (PBS), puis procéder comme pour une culture liquide.
3. Une fois le frottis séché à l’air, passez la lame enduite à travers une flamme deux ou trois fois.
Ceci tue les microbes dans le frottis et fixe l’échantillon à la lame, veillez à ne pas surchauffer l’échantillon cependant car cela peut fausser la morphologie cellulaire.,
la coloration de Gram de la procédure – la coloration de Gram d’un échantillon
1. Inondez doucement le frottis avec de la violette cristalline et laissez reposer 1 minute. Inclinez légèrement la lame et rincez doucement avec de l’eau du robinet ou de l’eau distillée.
crystal violet est un colorant soluble dans l’eau qui pénètre dans la couche de peptidoglycane dans la paroi cellulaire bactérienne.
2. Inondez doucement le frottis avec de L’iode de Gram et laissez reposer 1 minute. Inclinez légèrement la lame et rincez doucement avec de l’eau du robinet ou de l’eau distillée. Le frottis apparaîtra maintenant violet.,
la solution d’iode de Gram (iode et iodure de potassium) est ajoutée pour former un complexe avec le cristal violet, qui est beaucoup plus grand et insoluble dans l’eau.
3. Décolorer le frottis en utilisant 95% d’alcool éthylique ou d’acétone. Inclinez légèrement la lame et appliquez l’alcool goutte à goutte jusqu’à ce que l’alcool soit presque clair (5-10 secondes). Rincer immédiatement à l’eau pour éviter une décoloration excessive.
Le décolorant déshydrate la couche de peptidoglycane, la rétrécit et la resserre., Chez les bactéries à Gram positif, les grands complexes cristallins violet-iode sont alors incapables de pénétrer et d’échapper à l’épaisse couche de peptidoglycane, ce qui donne des cellules colorées pourpres. Cependant, chez les bactéries à Gram négatif, la membrane externe est dégradée, la fine couche de peptidoglycane est incapable de retenir les complexes cristallins violet-iode et la couleur est perdue.
4. Inonder doucement de contre-coloration safranine et laisser reposer 45 secondes. Inclinez légèrement la lame et rincez doucement avec de l’eau du robinet ou de l’eau distillée.,
La safranine est faiblement soluble dans l’eau et tache les cellules bactériennes d’un rouge clair, permettant la visualisation des cellules Gram négatives sans interférer avec l’observation du violet des cellules Gram positives.
5. Tamponnez la lame à sec sur du papier filtre puis visualisez le frottis à l’aide d’un microscope optique sous immersion dans l’huile.
couleur Gram positif vs Gram négatif
bactéries Gram positives
Les bactéries Gram positives ont un aspect violet distinctif lorsqu’elles sont observées au microscope optique après la coloration Gram., Cela est dû à la rétention de la tache violette de cristal violet dans l’épaisse couche de peptidoglycane de la paroi cellulaire. Des exemples de bactéries Gram positives comprennent tous les staphylocoques, tous les streptocoques et certaines espèces de listeria.
bactéries Gram négatives
Les bactéries Gram négatives apparaissent d’une couleur rougeâtre pâle lorsqu’elles sont observées au microscope optique après la coloration Gram. En effet, la structure de leur paroi cellulaire est incapable de retenir la tache violette cristalline et n’est donc colorée que par la contre-coloration safranine., Des exemples de bactéries Gram négatives comprennent les entérocoques, les espèces de salmonella et les espèces de pseudomonas.
La coloration de Gram ne peut pas être utilisée de manière fiable pour évaluer les relations phylogénétiques bactériennes. On pense que la membrane unique des espèces à Gram positif est l’état ancestral. Historiquement, on pensait que la deuxième membrane trouvée sur les bactéries à Gram négatif n’avait évolué qu’une seule fois et que toutes les espèces à Gram négatif étaient donc plus étroitement liées les unes aux autres qu’elles ne l’étaient aux espèces à Gram positif., Cependant, l’analyse génétique a depuis montré que ce n’était pas le cas et il est probable qu’il ait évolué plusieurs fois dans différentes lignées – Un produit d’évolution convergente.