résumé
en plus des anomalies du moteur et de la posture, les enfants atteints de paralysie cérébrale (CP) ont souvent une déficience intellectuelle. En tant que thérapie complémentaire et alternative de Médecine Traditionnelle Chinoise (TCM), le massage chinois Tuina, également appelé Tuina en Chine, a été largement appliqué dans le traitement clinique du CP en Chine depuis longtemps. Cependant, la base moléculaire de cela reste encore largement inconnue., Récemment, l’hydroxyméthylation de L’ADN s’est avérée sensible à l’environnement et joue un rôle critique dans certains troubles neurologiques, alors que la recherche axée sur la relation entre 5 hmC et la thérapie Tuina pour la paralysie cérébrale est déficiente. Dans notre étude, nous avons d’abord observé que Tuina améliorait les fonctions d’apprentissage et de mémoire des chiots de rat hypoxique-ischémique (HI). Pendant ce temps, le niveau de 5 hmC du cortex du lobe temporal dans le modèle de rat néonatal HI est significativement diminué par rapport à celui des rats des groupes contrôle et Tuina., Ensuite, nous avons utilisé la méthode Hmedip-Seq pour explorer si et comment l’hydroxyméthylation de l’ADN est impliquée dans la thérapie Tuina pour la paralysie cérébrale. L’annotation génomique des Dhmr de l’hypo-hydroxyméthylation des gènes du groupe HI a révélé un enrichissement dans de multiples voies de signalisation neurodéveloppementales. De plus, nous avons constaté que l’appauvrissement de 5 modifications hmC dans les gènes associés au développement neuronal s’accompagnait d’une réduction des niveaux d’ARNm de ces gènes., Pris ensemble, nos résultats indiquent que Tuina peut réguler l’expression des gènes liés au neurodéveloppement en modifiant l’état de l’hydroxyméthylation de l’ADN, améliorant ainsi les fonctions d’apprentissage et de mémoire de la paralysie cérébrale.
1. Introduction
Les lésions cérébrales survenant pendant la période périnatale sont une cause majeure d’invalidité acquise., L’apparition de lésions cérébrales chez les nourrissons est corrélée à de multiples facteurs, tels que l’hypoxie-ischémie, l’infection, le stress oxydatif et la réponse inflammatoire parmi lesquels l’hypoxie-ischémie (HI) peut induire une paralysie cérébrale (CP) en déclenchant des lésions cérébrales périnatales chez les prématurés . La CP est l’incapacité chronique néonatale la plus courante, caractérisée par des déficiences motrices et posturales, et s’accompagne souvent de déficits cognitifs et d’apprentissage . Dans les études scientifiques fondamentales, le modèle de rat néonatal HI a été largement utilisé pour explorer les résultats comportementaux et la pathogenèse de la paralysie cérébrale ., Malgré les grands progrès dans les études de CP, les mécanismes moléculaires de la façon dont l’hypoxie-ischémie contribue au développement et à la progression de CP restent encore flous.
à ce jour, les thérapies actuelles pour la CP comprennent principalement la chirurgie orthopédique, les médicaments antispasticité, et divers types d’interventions d’apprentissage moteur , dont la plupart fonctionnent simplement pour traiter les complications liées à la CP et peuvent entraîner des effets secondaires., Cependant, la médecine traditionnelle chinoise( MTC), y compris la Tuina, l’acupuncture et la phytothérapie, seule ou combinée à une thérapie conventionnelle de la médecine occidentale, a été largement utilisée comme traitement alternatif pour la PC en Chine . Le Tuina est une forme ancienne de massage médical en médecine chinoise, avec une pression des doigts appliquée sur les points d’acupuncture qui sont soi-disant sensibilisés par une altération des organes . Notamment, Tuina, en tant qu’intervention plus sûre et plus efficace, a montré des effets évidents sur la paralysie cérébrale dans la pratique clinique. Cependant, le mécanisme exact du fonctionnement de Tuina sur CP n’a pas encore été élucidé.,
au contraire, il a déjà été prouvé que les modifications épigénétiques sensibles à l’environnement sont impliquées dans la neurogenèse, l’apprentissage et la mémoire , ainsi que dans la plasticité synaptique . Parmi diverses modifications épigénétiques, la méthylation de l’ADN sur le cinquième carbone de la cytosine (5-méthylcytosine, 5 mC) est la modification épigénétique la plus étudiée qui joue des rôles importants dans le remoulage de la structure de la chromatine, la suppression transcriptionnelle et la différenciation cellulaire ., En outre , l’oxydation de 5 mC en 5-hydroxyméthylcytosine (5 hmC) par la famille de gènes ten-eleven translocation (TET) est proposée comme un nouveau mécanisme pour l’élimination de 5 mC, et 5 hmC a été suggéré pour être critique dans le maintien de la structure et des fonctions des neurones en raison de son enrichissement évident dans le cerveau . Pendant ce temps, l’altération de 5 hmC est également identifiée par de nombreuses études comme étant associée à des troubles neurologiques , tels que la maladie d’Alzheimer , le syndrome de Rett , le syndrome de tremblement/ataxie associé à L’X fragile , la maladie de Huntington et les troubles du spectre autistique ., Ces preuves ont fourni la base de l’hypothèse selon laquelle les altérations de 5 hmC pourraient jouer un rôle critique dans les maladies du système nerveux.,
pour explorer la présence de L’implication de la thérapie Tuina dans l’altération de la 5 hmC dans la CP, nous avons appliqué une méthode établie de marquage chimique et de purification par affinité couplée à une technologie de séquençage à haut débit pour révéler les altérations possibles de la 5 hmC à l’échelle du génome chez les rats HI avant et après le traitement Tuina afin de rechercher la relation entre la 5 hmC et les effets thérapeutiques Tuina sur la CP, fournissant ainsi des preuves à l’appui de l’application de la thérapie Tuina pour la paralysie cérébrale.
2. Matériaux et méthodes
2.1., Modèle Animal
toutes les expériences ont été approuvées par le Comité D’éthique pour les soins aux animaux de L’Hôpital Jinshan affilié à L’Université Fudan. Un modèle Rice–Vannucci modifié a été utilisé comme décrit précédemment . Le modèle HI néonatal a été réalisé sur des chiots mâles de rat Sprague-Dawley (Slac Laboratory Animal Company, Shanghai, Chine) le jour postnatal 3 (P3) par ligature de l’artère carotide commune gauche sous anesthésie isoflurane à 3%. Le temps de chirurgie pour chaque rat a été contrôlé dans les 10 minutes., Après récupération pendant 1 heure, ces chiots ont été placés dans une chambre d’hypoxie à 37°C et soumis au mélangeur de gaz composé de 8% D’O2 et 98% de N2 pendant 3,5 heures. Les animaux fictifs ont eu la même opération pour exposer l’artère carotide commune sans ligature ni hypoxie. Après la chirurgie, les chiots de rat ont été retournés dans leur cage d’origine.
2.2. Traitement Tuina
Le traitement Tuina a été effectué par un chercheur spécialisé avec certificat de médecin professionnel. Du jour de P4 à P31, les chiots de rat du groupe Tuina ont accepté L’intervention Tuina qui est effectuée 120 fois / min pendant 15 minutes, une fois par jour.,f Tuina est la suivante: premièrement, le rat a été placé sur la paume de la main gauche du manipulateur pour s’adapter à l’environnement; deuxièmement, le manipulateur a utilisé le majeur de sa main droite pour frotter doucement le rat du cou à la queue trois fois pour détendre ses muscles; troisièmement, le Tuina a été effectué par frottement successif, pétrissage, et un doigt poussant le long de la colonne vertébrale des rats de haut en bas et de l’intérieur sur les ligaments dorsaux et ambilatéraux ainsi que les muscles le long du méridien du et du méridien de la vessie du rat en référence à la médecine traditionnelle chinoise connexe (TCM) fonctionne.,
2.3. Réflexe de redressement
le réflexe de redressement des rats nouveau-nés a été évalué de P5 à P11, comme décrit précédemment . Au cours de cet essai, les chiots de rat ont été placés en décubitus dorsal sur une surface plane nettoyée et le temps pour ces chiots d’atteindre la position couchée avec les quatre pattes a été mesuré.
2.4. Réflexe de marche
les chiots de Rat ont été placés au centre d’un carton blanc arrondi (13 cm de diamètre), et le jour où ils ont quitté le cercle avec les deux membres antérieurs a été enregistré .
2.5., Essai sur plan incliné
Ce test a été utilisé pour mesurer la force des membres en enregistrant l’angle maximal de la pente sur laquelle les petits de rat peuvent encore s’agripper le jour du P21, comme le montre la Figure 1(b) . Au cours de cet essai, les rats ont été placés face à droite ou à gauche et l’angle du Plan a été augmenté de 5° toutes les cinq secondes afin de déterminer l’angle maximal de la pente sur laquelle le rat pouvait encore tenir .
2.6. Test d’évitement abaisseur
Ce test a été mis en œuvre pour mesurer la rétention de mémoire . Un rat a été doucement placé sur une plate-forme d’isolation cylindrique (4.,5 cm de diamètre et de hauteur) dans une chambre de conditionnement pour s’adapter à l’environnement pendant 3 min. Une fois que le rat descend la plate-forme, il sera électrifié immédiatement. Au cours de la séance d’entraînement de 5 minutes (P26), les rats ont été entraînés à sauter de nouveau sur la plate-forme pour éviter la stimulation électrique. Dans les sessions de test (24 h après l’entraînement, C’est-à-dire P27), le temps de latence (le temps pour que les rats descendent de la plate-forme pour la première fois) et le nombre d’erreurs (fréquence des rats quittant la plate-forme) ont été enregistrés.
2.7., Test Morris Water Maze (MWM)
afin d’évaluer l’apprentissage spatial et la mémoire, le test Morris water maze a été effectué pendant 5 jours comme décrit précédemment . Le labyrinthe aquatique (Shanghai Xinyuan Information Technology Company, Shanghai, Chine) a été divisé en quatre quadrants et une plate-forme (5 cm de diamètre) a été placée à 1 cm sous la surface de l’eau dans un quadrant. Dans les séances de formation (P27–P30), tous les rats ont été entraînés quatre fois par jour pendant quatre jours consécutifs, et ils ont été autorisés à trouver la plate-forme cachée dans les 60 s., Si le rat ne parvenait pas à trouver la plate-forme dans les 60 s, il était doucement guidé vers la plate-forme et autorisé à y rester pendant 30 s avant d’être renvoyé dans la cage. Le jour de l’essai spatial probe (P31), la plate-forme a été retirée et les rats ont été relâchés dans l’eau face au mur de la piscine à partir de la même position que lors des séances d’entraînement. Par la suite, les pistes de mouvement et le nombre de passages à niveau ont été enregistrés.
2.8., Dot Blotting
Après l’achèvement des tests ci-dessus, les chiots de rat ont été sacrifiés sur P31 et leurs cerveaux ont été disséqués pour recueillir l’ADN total du cortex temporal gauche par un mini kit D’ADN QIAamp (Qiagen, Allemagne). 2,5 µL d’ADN génomique (100 ng/µL) ont été repérés sur des membranes en nylon, suivies d’une cuisson à 80°C pendant 30 min pour réticuler l’ADN . Après blocage avec 5% de lait non gras pendant 1 h à température ambiante, la membrane a été incubée avec un anticorps polyclonal 5 hmC (dilution 1: 1000, motif actif, États-Unis, Cat. Aucun., 39769) à 4°C pendant la nuit et l’anticorps secondaire conjugué à la peroxydase de raifort (HRP) a été utilisé pour sonder le lendemain. La membrane dot blot a été colorée avec 0,02% de bleu de méthylène (MB) pour assurer une charge égale.
2.9. Analyse d’immunoprécipitation d’ADN hydroxyméthylé (Hmedip) et séquençage à haut débit
L’ADN génomique a été extrait du cortex temporal gauche des chiots de rat (témoin: n = 3; HI: n = 3; Tuina: n = 3) et soniqué à 200-350 paires de bases (bp). Et les fragments D’ADN ont été réparés; les adaptateurs a-tailed et Illumina ont été ligaturés., Ensuite, l’ADN ligaturé par adaptateur a été dénaturé et incubé avec 5 anticorps hmC (motif actif, États-Unis, Cat. No. 39769) à 4°C pendant la nuit. Les complexes anticorps-ADN ont été capturés par des billes de protéine A/G. L’ADN immunoprécipité a été purifié et a subi un séquençage à haut débit effectué sur le système Illumina Hiseq3000 (Illumina, États-Unis) .
2.10. Cartographie des données de séquençage et bioinformatique
Le traitement des données de séquençage a été effectué comme décrit précédemment . Les fichiers de séquence FASTQ après duplications biologiques ont été alignés sur le génome de référence du rat UCSC (RGSC6 .0 / rn6)., Des lectures uniques et non dupliquées ont été utilisées pour l’appel de crête et l’annotation par l’optimisation hypergéométrique de l’enrichissement de motif (HOMER) . Les pics d’enrichissement en 5-hmC ont été déterminés à l’aide d’une analyse basée sur un modèle du logiciel ChIP-Seq (MACS). Et des régions différentiellement hydroxyméthylées (Dhmr) ont été identifiées parmi toutes les paires d’échantillons enrichis en 5-hmC en comparant directement un échantillon avec un autre dans toutes les directions . Des analyses d’ontologie génique (GO) ont été effectuées à L’aide du DAVID .
2.11. RT-PCR Quantitative
L’ARN Total a été extrait du cortex du lobe temporal gauche., La transcription inverse de l’ADNc a été réalisée à L’aide du PrimeScript RT Master Mix Kit (Takara, Japon). Des réactions quantitatives RT-PCR ont été réalisées sur 7500 systèmes PCR en temps réel (Applied Biosystems, États-Unis) à L’aide de SYBR green (Takara, Japon). la β-actine a été utilisée comme contrôle interne et l’expression relative du gène cible a été déterminée par la méthode 2−ΔΔCT., The sequences of primers used in the present experiment were listed as follows: Prkg2 primer (forward 5′-CCTCTGGATGTTCACCGCAAGAC-3′, reverse 5′-AGGTCATAGGTCCGGCTTGTGG-3′), Casd1 primer (forward 5′-GAGAGCAGACGGATGAATGGAAGG-3′, reverse 5′-AACAGATAAGCAGCCACCAGAACG-3′), Slc44a1 primer (forward 5′-ACACAGCCACAGCCATCAATAGC-3′, reverse 5′-CAGCCACTCGCAGAGCATTCTC-3′), and β-actin primer (forward 5′-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3′, reverse 5′-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3′).
2.12., Western Blotting Assay
le cortex du lobe temporal gauche isolé a été ajouté avec du lysat de protéine glacé et centrifugé à 12000 tr/min pendant 20 min à 4°c. des échantillons de protéines ont été séparés par électrophorèse à L’aide de SDS-PAGE et transférés sur des membranes PVDF (Millipore, États-Unis). Après blocage avec du lait non gras à 5% pendant 2 h à température ambiante, les membranes ont été incubées avec les anticorps primaires à 4°C pendant une nuit, puis incubées avec des anticorps IgG secondaires conjugués au HRP. Les anticorps primaires utilisés ici comprenaient anti-Tet1 (1 : 1000, Abcam, UK, Cat. Aucun., 191698), anti-Tet2 (1: 1000, Millipore, États-Unis, Cat. # ABE364), anti-Slc44a1 (1: 1000, Abcam, Royaume-Uni, Cat. No. 110767), et anti-β tubuline (1: 2000, Cell Signaling Technology, États-Unis, Cat. #2128). Les membranes ont ensuite été développées en utilisant la détection ECL, et les signaux ont été détectés avec le système D’imagerie chimiluminescente Tanon-5200 (Tanon, Shanghai, Chine). Les niveaux de protéines ont été analysés par le logiciel Image J (NIH, Bethesda, USA) et normalisés au niveau de β-tubuline correspondant.
2.13., Microscopie confocale par Immunofluorescence
des petits de Rat ont été sacrifiés sur P31, et leur cœur a été perfusé avec 0,9% de solution saline suivie de 4% de paraformaldéhyde (PFA). Après perfusion, les cerveaux ont été disséqués et fixés dans 4% de PFA pendant la nuit, puis incorporés dans de la paraffine et transformés en sections en série de 5 µm. Après récupération de l’antigène par micro-ondes dans un tampon d’acide citrique à 95°C, les sites non spécifiques ont été bloqués avec 5% d’albumine sérique bovine (BSA) pendant 1 h à température ambiante. Ensuite, les sections cérébrales ont été incubées avec 5 anticorps primaires hmC (1 : 1000, motif actif, États-Unis, Cat. Aucun., 39769) une nuit à 4°C suivie d’une incubation avec l’anticorps secondaire (1 : 200, Life Technology, États-Unis) 1 h à 37°C. 4′,6-diamino-2-phénylindole (DAPI) a été utilisé pour la coloration par immunofluorescence nucléaire, et les images d’immunofluorescence ont été visualisées et capturées au microscope confocal (Leica sp5, Allemagne).
2.14. Analyse statistique
toutes les données ont été exprimées en moyenne ± erreur type de la moyenne (SEM) et analysées à l’aide de SPSS., L’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) a été appliquée pour déterminer les différences entre les 3 groupes, suivie du test t non paramétrique et du test de différence honnêtement significative de Tukey. la valeur <0,05 a été considérée comme statistiquement significative.
3. Résultats
Tuina a amélioré la perte de poids, la faiblesse de la force des membres et les troubles des réflexes neurologiques induits par L’HI.,
le poids corporel des petits de rat a été mesuré de P4 à P28, et il a été constaté que, de P22 à P28, le poids corporel des rats du groupe Tuina (n = 11) a augmenté significativement par rapport au groupe HI (n = 11; Figure 1(a)). Les résultats de l’essai sur plan incliné ont montré que les angles maximaux étaient plus élevés dans le groupe Tuina que dans le groupe HI (Figure 1(b)), ce qui indique une amélioration de la faiblesse de la force des membres dans le groupe Tuina., Les résultats des réflexes du système nerveux étaient les suivants: dans le test des réflexes de la marche, les petits de rat du groupe HI ont commencé à s’éloigner du cercle avec les deux membres antérieurs significativement plus tard que ceux des groupes contrôle et Tuina (Figure 1(c)). Dans le test réflexe de redressement, les rats du groupe Tuina ont mis moins de temps à se redresser que ceux du groupe HI De P7 à P11 (Figure 1(d)).
Tuina a promu les fonctions d’apprentissage et de mémoire des chiots de rats hypoxiques-ischémiques.,
Le test Morris water maze et le test step-down ont été effectués pour évaluer les fonctions d’apprentissage et de mémoire des rats. Comme le montre la Figure 2 (a), les traces de mouvement le jour de l’essai de la sonde de l’essai MWM montrent que le nombre de passages à l’emplacement de la plate-forme du groupe HI était significativement inférieur à celui du groupe témoin et du groupe Tuina (Figure 2(b)). Dans le test abaisseur, les rats HI ont montré un temps de latence significativement plus court et plus d’erreurs par rapport aux rats témoins et Tuina (Figures 2(c) et 2(d)).
Tuina a augmenté les niveaux de 5 hmC et de Tet2 dans le cortex temporal cérébral des rats HI.,
afin d’examiner si le niveau de 5 hmC a été affecté pendant le développement du CP, nous avons effectué des tests dot blot et observé que le niveau de 5 hmC chez les rats HI a diminué significativement par rapport à celui du témoin, alors que ce niveau a été partiellement augmenté après Tuina (; Figure 3(A)). Pendant ce temps, la coloration par immunofluorescence a démontré la fusion de la coloration 5 hmC et de la coloration DAPI et L’HI a entraîné une diminution de la 5 HMC génomique dans le cortex temporal gauche, tandis que le traitement Tuina a rétabli le niveau de 5 hmC dans une certaine mesure (Figure 3(b)), ce qui était en cohérence avec, De plus, comme le montrent les Figures 3 (c) et 3 (d), le groupe HI a montré une diminution de L’expression de Tet1 et Tet2 par rapport au groupe témoin, alors que seul Tet2 a été augmenté après le traitement par Tuina.
3.1. Modification et Distribution du hmc 5 à l’échelle du génome
pour étudier l’emplacement exact et la distribution du hmc 5 à l’échelle du génome, une immunoprécipitation de L’ADN hydroxyméthylé (hmedip) suivie d’un séquençage de nouvelle génération (hmedip-seq) a été réalisée., Les rats, respectivement, des groupes témoin (n = 3), HI (n = 3) et Tuina (n = 3) ont été sacrifiés sur P31, et L’ADN génomique du cortex du lobe temporal gauche a été extrait pour hmedip-seq. On a évalué le profil de 5 hmC à l’échelle du génome en comptant 5 lectures cartographiées par hmC dans chaque bac de 10 Ko à partir des échantillons des groupes contrôle, Tuina et HI, puis on l’a normalisé jusqu’à la couverture totale du séquençage . Comme le montrent les Figures 4 (a) -4(c), la distribution des 5 lectures HMC à l’échelle du génome dans les trois groupes était différente, puis nous avons exploré plus en détail les régions génétiques spécifiques dans lesquelles ces différences existent., La Figure 4 (d) montre le chevauchement des caractéristiques de densité normalisée de 5 lectures hmC avec les caractéristiques génomiques connues sur des corps de gènes définis et des îlots CGI (CPG) selon le tableau UCSC pour RGSC6.0/rn6. En outre, comme le montre la Figure 4 (e), les distributions de 5 hmC au niveau des corps géniques et de 1 kb en amont et en aval des corps géniques ont également été étudiées., On peut observer à partir des Figures 4(d) et 4(e) que le niveau 5 hmC du groupe HI diffère de ceux du groupe témoin et du groupe Tuina à l’extrémité 5′ du corps génomique, en particulier aux sites de ±500 PB des sites de départ transcriptionnel (TSS) et de L’IGC à moins de 500 PB du TSS.
3.2. Identification et Annotation de régions différentiellement Hydroxyméthylées (Dhmr)
pour identifier les loci spécifiques présentant des profils hmC 5 altérés, nous avons procédé à l’identification et à la caractérisation des Dhmr spécifiques de tous les autosomes et chromosomes sexuels à travers le génome., Fait intéressant, il y avait une grande différence dans la distribution des hyper-DhMRs et des hypo-DhMRs sur le chromosome X (Figures 5(a)-5(c)). Pour explorer davantage la signification biologique des Dhmr trouvés, les gènes associés à ces Dhmr ont été extraits pour une analyse d’enrichissement en ontologie génétique (GO)., Comme le montrent les Figures 5 (d) et 5 (e), L’analyse D’enrichissement GO a indiqué que ces hypo-Dhmr dans le groupe HI ont été trouvés fortement enrichis sur les voies fonctionnelles liées au neurodéveloppement et aux fonctions neuronales, y compris la croissance cellulaire développementale, l’extension de la projection neuronale, la régulation positive de la croissance développementale, la croissance développementale impliquée,
sur la base de l’analyse complète des listes de gènes différentiels d’hydroxyméthylation des trois groupes, nous avons sélectionné six gènes associés à l’hypo-DhMRs du groupe HI qui étaient tous associés aux fonctions du système nerveux pour étudier la relation entre 5 altérations hmC et les niveaux de transcription de ces gènes., Comme on pouvait s’y attendre, il a été constaté que, conformément à la modification réduite de 5 hmC dans Casd1, Prkg2 et Slc44a1, les niveaux d’ARNm correspondants ont également diminué de manière significative dans le groupe HI par rapport à ceux des groupes contrôle et Tuina (Figure 5(f)).
4. Discussion
avec une innocuité générale et une efficacité réputée, la médecine traditionnelle chinoise (MTC) est facilement acceptée par la population générale partout dans le monde. La MTC a été largement appliquée dans diverses maladies pédiatriques , telles que le sarcome D’Ewing , l’asthme , la maladie de Graves et les troubles allergiques pédiatriques ., Pendant ce temps, il existe également des études indiquant que les thérapies de MTC, y compris le Tuina, les médicaments à base de plantes et l’acupuncture, sont bien tolérées et ont des effets thérapeutiques positifs sur la paralysie cérébrale . En raison des résultats cliniques prometteurs et de moins d’effets secondaires, le massage chinois Tuina a suscité un intérêt croissant en termes de traitement de la CP.
en tant que nouvelle modification épigénétique, 5 hmC sert non seulement d’intermédiaire dans les processus de déméthylation de l’ADN, mais agit également comme un marqueur épigénétique stable au cours du développement de diverses maladies ., 5 hmC est environ dix fois plus enrichi dans les neurones que dans les autres cellules et sa régulation dynamique est essentielle dans le neurodéveloppement postnatal . De plus, l’altération du niveau global de hmC 5 a été considérée comme étroitement liée à de nombreux troubles neurodégénératifs et maladies neurodéveloppementales .
cependant, à notre connaissance, peu d’études se sont concentrées sur le lien entre l’hydroxyméthylation de l’ADN et la paralysie cérébrale, ce qui est devenu l’inspiration de nos recherches., Dans notre étude, les résultats du DOT blotting et de l’immunofluorescence ont révélé que le niveau global de 5 hmC dans le cortex du lobe temporal cérébral était significativement diminué après une lésion HI, ce qui est cohérent avec le niveau réduit de 5 hmC dans le rein de souris après ischémie-reperfusion . Cependant, après le traitement par Tuina, le taux de hmC 5 dans le groupe Tuina était supérieur à celui du groupe HI., En outre, il est connu que 5 hmC est produite par oxydation de 5 mC par les protéines Tet, sur la base de laquelle nous avons détecté les niveaux de protéines Tet1 et Tet2 et constaté que les deux niveaux étaient significativement diminués après la lésion HI, alors que seule la protéine Tet2 a été augmentée après le traitement Tuina. Dans l’ensemble, ces résultats impliquent que l’expression réduite de Tet1 et de Tet2 peut contribuer à la diminution de 5 hmC après une lésion de L’HI et que Tuina peut augmenter le niveau de 5 hmC en augmentant L’expression de Tet2.,
Au contraire, la méthylation CGI chez les promoteurs a été jugée critique dans le silençage génique et le 5 hmC pourrait jouer un rôle dans l’expression génique médiée par la déméthylation de l’ADN . Dans notre étude, le groupe HI a montré une diminution de l’enrichissement de 5 hmC à l’échelle du génome dans CGI à moins de 500 PB du TSS par rapport aux groupes contrôle et Tuina, tandis que Tuina a augmenté la distribution de 5 hmC à l’échelle du génome., Parallèlement, conformément aux résultats précédents selon lesquels l’enrichissement de 5 hmC dans le corps du gène peut avoir une forte corrélation avec l’augmentation de la transcription des gènes concernés dans les neurones , nos résultats de RT-PCR ont montré que l’appauvrissement de la modification de 5 hmC dans les gènes Prkg2, Casd1 et Slc44a1 s’accompagnait de la réduction des niveaux d’ARNm de ces gènes dans le groupe HI., Sur la base de tous ces résultats mentionnés ci-dessus, il a été indiqué que la modification de la 5 hmC pourrait jouer un rôle critique dans la pathogenèse de la CP en régulant la transcription et l’expression des gènes liés aux fonctions neuronales et que Tuina pourrait produire des effets thérapeutiques sur la CP en modulant la 5 hmC.
plus intéressant, il a été constaté que la CP et les troubles du développement connexes sont plus fréquents chez les patients de sexe masculin et le modèle murin néonatal féminin de lésion cérébrale HI a également montré une occurrence plus faible de la CP spécifique au sexe , dont la raison est encore incertaine., Afin d’éviter la perturbation de ces effets protecteurs spécifiques au sexe, seuls les petits mâles de rat ont été sélectionnés pour notre étude. Remarquablement, dans la carte circulaire à l’échelle du génome (Figure 5(a)), de grandes différences dans la distribution des hyper-DhMRs et des hypo-DhMRs sur le chromosome X ont été observées à partir de la comparaison entre deux groupes dans notre étude, ce qui confirme davantage la corrélation entre le sexe et l’apparition de la paralysie cérébrale., Notamment, en raison des limites de notre laboratoire, nous ne pouvions pas faire de contrôle IgG ou générer les bibliothèques d’entrée, et les Dhmr ont été identifiés en comparant directement l’un à l’autre plutôt que de comparer à l’entrée, que nous aurons l’intention d’améliorer dans nos futures études pour rendre la recherche plus précise.
de plus, des analyses GO de gènes associés à l’hypo-DhMRs dans le groupe HI ont montré que ces gènes sont fortement enrichis dans de multiples voies de signalisation liées au neurodéveloppement et aux fonctions neuronales., Dans notre expérience, un retard de croissance et des troubles neurodéveloppementaux sont apparus dans le groupe HI sous la forme d’une perte de poids, d’une faiblesse de la force des membres et de plusieurs troubles réflexes neuronaux qui ont été améliorés dans une certaine mesure par le traitement Tuina. De plus, à partir des résultats du test Morris water maze et du test step-down avoidance, Tuina a amélioré de manière significative les fonctions d’apprentissage et de mémoire des rats hypoxiques-ischémiques., Ces résultats indiquent la corrélation entre l’altération des loci de la 5-hydroxyméthylcytosine et le développement neuronal et suggèrent en outre que la thérapie Tuina peut influencer le développement du cerveau et les fonctions cognitives cérébrales via la modulation de l’hydroxyméthylation de l’ADN.
dans la présente étude, nous avons fourni des cartes de 5 hmC à l’échelle du génome des groupes contrôle, HI et Tuina et avons révélé une altération du statut d’hydroxyméthylation de l’ADN et un changement dynamique de 5 HMC après le traitement par Tuina, ce qui pourrait éclairer le mécanisme thérapeutique possible de Tuina pour le CP.,
la Disponibilité des Données
Les données utilisées pour appuyer les conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l’auteur sur demande.
les Conflits d’Intérêts
Les auteurs déclarent n’avoir aucun conflit d’intérêt.
Contributions des auteurs
Yunpeng Zhang et Chao Gao ont également contribué à ce travail.,
Remerciements
Ce travail a été soutenu par la Fondation Nationale des sciences naturelles de Chine (81774444), le projet de recherche scientifique et technologique de la province Du Henan (182102310403), le projet de recherche clinique coopérative Chine-Canada, le programme D’études à l’étranger de la Province Du Henan (201721) et le projet de recherche