możliwość odróżnienia gatunków bakterii jest ważna z wielu powodów, od diagnozowania infekcji lub sprawdzania bezpieczeństwa żywności, do określenia, który gatunek nadaje serowi fantastyczny charakter. Gatunki bakteryjne, a nawet specyficzne szczepy mogą być zróżnicowane przy użyciu wielu technik molekularnych, takich jak PCR, ilościowe PCR, sekwencjonowanie genomu i spektrometria mas., Ale nawet bez dostania się do nitty molekularnej, istnieją różnice fenotypowe między grupami bakterii, które mogą być wykorzystane do ich odróżnienia. Obejmuje to cechy takie jak ich kształt (na przykład bacilli vs cocci), wzrost w poszczególnych składników odżywczych i preferencje dla środowiska o wysokiej lub niskiej zawartości tlenu. W zależności od badanej cechy, gatunki bakterii mogą być podzielone na szerokie grupy, ale zebrane razem Informacje mogą znacznie zawęzić możliwe tożsamości., Jedna z takich przydatnych klasyfikacji-jeśli bakteria jest Gram-dodatnia lub Gram-ujemna-opiera się na strukturze ścian komórkowych bakterii.
różnica w strukturze bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych
poniższy diagram ilustruje różnice w strukturze bakterii Gram-dodatnich i Gram-ujemnych. Dwie kluczowe cechy, które prowadzą do różnych właściwości wizualizacji Gram-dodatnich i Gram-ujemnych gatunków są grubość warstwy peptydoglikanu i obecność lub brak zewnętrznej błony lipidowej., Dzieje się tak, ponieważ struktura ściany wpływa na zdolność komórki do zatrzymywania krystalicznie fioletowej plamy używanej w procedurze barwienia grama, która może być następnie wizualizowana pod mikroskopem świetlnym.
bakterie Gram-dodatnie mają grubą warstwę peptydoglikanu i nie zewnętrzną błonę lipidową, podczas gdy bakterie Gram-ujemne mają cienką warstwę peptydoglikanu i mają zewnętrzną błonę lipidową.
ponieważ bakterie Gram-dodatnie nie posiadają zewnętrznej błony lipidowej, przy prawidłowym odwołaniu się do ich struktury, a nie właściwości barwienia, określane są jako monodermy., Zewnętrzna błona lipidowa posiadana przez bakterie Gram-ujemne oznacza, że odnosząc się do ich struktury fizycznej, określa się je mianem diderms.
technika barwienia grama została opracowana w 1884 roku przez duńskiego bakteriologa Hansa Christiana grama. Podczas gdy plama grama nie powie Ci konkretnego gatunku, na który patrzysz, może to być szybki sposób na znaczne zawężenie listy potencjalnych kandydatów i bezpośrednie testy następcze w razie potrzeby.,
bejca Gram – dodatnia vs bejca Gram-ujemna
procedura bejcy Gram-przygotowanie próbki
1. Oznakuj szkiełko mikroskopu czystym szkłem z identyfikacją próbki. Upewnij się, że używasz ołówka, ponieważ wiele atramentów jest usuwanych przez odczynniki używane w procedurze barwienia.
2 . Przygotowując szkiełko z płynnej kultury bakteryjnej:
przy pomocy sterylnej pętli nakleić na szkiełko małą kroplówkę. Delikatnie posmarować kropelkę ruchem okrężnym w obszar o średnicy około 1 cm., W przypadku bardzo gęstych kultur może być konieczne wstępne rozcieńczenie kultury, aby zapewnić, że poszczególne komórki bakteryjne mogą być widoczne pod mikroskopem po barwieniu.
Jeśli materiał źródłowy pochodzi z płytki bakteryjnej:
rozpuścić pętlę materiału kolonijnego w sterylnej soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS), a następnie postępować tak, jak w przypadku Kultury płynnej.
3. Gdy rozmaz wyschnie powietrzem, przeprowadź rozmazany szkiełko przez płomień dwa lub trzy razy.
to zabija drobnoustroje w rozmazie i mocuje próbkę do szkiełka, należy uważać, aby nie przegrzać próbki, ponieważ może to zniekształcić morfologię komórkową.,
grama stain procedure-grama staining a sample
1. Delikatnie zalej rozmaz fioletem kryształowym i pozostaw na 1 minutę. Lekko przechylić prowadnicę i delikatnie spłukać wodą z kranu lub wodą destylowaną.
fiolet krystaliczny jest rozpuszczalnym w wodzie barwnikiem, który wchodzi do warstwy peptydoglikanu w ścianie komórkowej bakterii.
2 . Delikatnie zalej rozmaz jodem grama i pozostaw na 1 minutę. Lekko przechylić prowadnicę i delikatnie spłukać wodą z kranu lub wodą destylowaną. Rozmaz będzie teraz fioletowy.,
roztwór jodu grama (jodek jodu i potasu) dodaje się tworząc kompleks z fioletem krystalicznym, który jest znacznie większy i jest nierozpuszczalny w wodzie.
3. Odbarwić rozmaz za pomocą 95% alkoholu etylowego lub acetonu. Lekko przechylić suwak i nałożyć kroplę alkoholu po kropli, aż alkohol będzie prawie czysty(5-10 sekund). Natychmiast spłucz wodą, aby uniknąć nadmiernego odbarwiania.
Decolorizer odwadnia warstwę peptydoglikanu, kurcząc ją i dokręcając., U bakterii Gram-dodatnich Duże krystaliczne kompleksy fioletowo-jodowe nie są wówczas w stanie przeniknąć i uciec z grubej warstwy peptydoglikanu, powodując fioletowe zabarwione komórki. Jednak u bakterii Gram-ujemnych zewnętrzna błona ulega degradacji, cienka warstwa peptydoglikanu nie jest w stanie utrzymać krystalicznych kompleksów fioletowo-jodowych i traci kolor.
4. Delikatnie zalej safranin counterstain i pozostaw na 45 sekund. Lekko przechylić prowadnicę i delikatnie spłukać wodą z kranu lub wodą destylowaną.,
Safranina jest słabo rozpuszczalna w wodzie i zabarwia komórki bakteryjne na jasnoczerwony, umożliwiając wizualizację komórek Gram-ujemnych bez ingerencji w obserwację Purpury komórek Gram-dodatnich.
5. Osuszyć szkiełko na papierze filtracyjnym, a następnie obejrzeć rozmaz za pomocą mikroskopu świetlnego w zanurzeniu olejowym.
kolor Gram-dodatni vs Gram-ujemny
bakterie Gram-dodatnie
bakterie Gram-dodatnie mają charakterystyczny fioletowy wygląd, gdy są obserwowane pod mikroskopem świetlnym po barwieniu grama., Jest to spowodowane zatrzymaniem fioletowej krystalicznej plamy fioletowej w grubej warstwie peptydoglikanu ściany komórkowej. Przykłady bakterii Gram-dodatnich obejmują wszystkie gronkowce, wszystkie paciorkowce i niektóre gatunki listeria.
bakterie Gram-ujemne
bakterie Gram-ujemne mają bladoczerwony kolor podczas obserwacji pod mikroskopem świetlnym po barwieniu grama. Dzieje się tak dlatego, że struktura ich ściany komórkowej nie jest w stanie utrzymać krystalicznie fioletowej plamy, więc są barwione tylko przez kontrstain safranin., Przykładami bakterii Gram-ujemnych są enterokoki, gatunki salmonella i gatunki pseudomonas.
barwienie metodą Grama nie może być rzetelnie wykorzystane do oceny zależności filogenetycznych bakterii. Pojedyncza błona gatunków Gram-dodatnich jest uważana za stan przodków. Historycznie uważano, że druga membrana znaleziona na bakteriach Gram-ujemnych wyewoluowała tylko raz, więc wszystkie gatunki Gram-ujemne były ze sobą bliżej spokrewnione niż gatunki Gram-dodatnie., Jednak analiza genetyczna wykazała, że tak nie jest i prawdopodobnie ewoluowała wielokrotnie w różnych liniach-produkt ewolucji zbieżnej.